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海水养殖中药物的合理使用及对危害性原生动物的防治,目前已是国际间公认的焦点问题之一。本研究以纤毛虫-扇形游仆虫为材料,选择当今养殖实践中常用药物一呋喃西林,探讨其对受试纤毛虫的抗氧化防御系统酶活性的影响；利用现代分子生物学手段(单细胞电泳、KCL-SDS、实时荧光RT-PCR)检测渔药对受试动物细胞DNA损伤和对相关基因表达水平的影响,从细胞及分子水平上综合评价呋喃西林的生态毒理学效应,探讨了呋喃西林的毒杀作用机理。
主要研究内容和结果包括:
1)测定了呋喃西林对扇形游仆虫单胺氧化酶、谷胱甘肽还原酶及过氧化氢酶活性的影响。与对照组相比,暴露于呋喃西林溶液中的扇形游仆虫这三种酶活性变化明显(P<0.05)。在长时间(36h)的暴露下,单胺氧化酶的活性显著低于对照组(P<0.05)；谷胱甘肽还原酶及过氧化氢酶活性显著高于对照组(P<0.05),结果表明呋喃西林显著影响受试纤毛虫的抗氧化防御系统和代谢系统酶活性。
2)利用单细胞凝胶电泳技术检测了呋喃西林诱导的扇形游仆虫DNA链的断裂。与对照组相比,呋喃西林处理组纤毛虫慧尾长度显著增长(P<0.05),尤其在15 mg/L呋喃西林暴露下慧尾长度最长(P<0.05),结果表明呋喃西林可造成扇形游仆虫DNA链的断裂。
3)利用KCL-SDS沉淀技术检测呋喃西林诱导的扇形游仆虫DNA-蛋白质交联(DPC)。结果显示,受试扇形游仆虫的DPC系数随着呋喃西林溶液浓度的升高而增加(P<0.05),且高浓度(25 mg/L)呋喃西林处理下扇形游仆虫的DPC系数始终最高(P<0.05)。表明呋喃西林可诱导DNA.蛋白质交联物含量的增加。
4)利用RACE技术,首次克隆了海洋纤毛虫.扇形游仆虫的过氧化氢酶基因的全长序列。其cDNA序列全长为1516bp,其中包含一个1428bp的开放阅读框(ORF),编码475个氨基酸。据预测该过氧化氢酶的理论等电点(pI)为6.5,预测的分子量为53.8KDa；利用实时荧光定量PCR技术分析了不同浓度呋喃西林处理下扇形游仆虫过氧化氢酶基因mRNA的表达水平。与对照组相比,呋喃西林处理后扇形游仆虫过氧化氢酶mRNA的表达量随药物浓度/处理时间的增加而呈现出上升趋势(P<0.05),表明过氧化氢酶mRNA表达水平对呋喃西林的应激比较敏感。