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本研究以榨菜(Brassica juncea(L.)Czern.et Coss.var.tumitda Tsen et Lee)与紫甘蓝(B.oleracea L.var.capitata L.)的茎尖嫁接嵌合体为材料,通过对组织培养条件下嵌合体茎段基部不定芽的诱导获得嵌合体的无性繁殖后代,利用该无性后代开展了嫁接诱导性状变异及其维持机制的分子机理研究。通过形态学观察以及分子标记鉴定,明确无性后代的细胞谱系;通过全基因组甲基化图谱分析,明确亲本和后代的DNA甲基化模式差异,分析DNA甲基化变异位点与变异性状的关系;通过small RNA高通量测序,解析嫁接引起的小RNA种类和表达量的变化,并通过对小干扰RNA(siRNA)和DNA甲基化的关联分析,明确全基因组甲基化差异位点与siRNA的关系,阐明siRNA调控甲基化变异的机理。通过对siRNA表达模式及甲基化酶转录水平的分析,探究嫁接诱导表观遗传变异的维持机制。主要结果如下:(1)以榨菜和紫甘蓝种间周缘嵌合体TCC[茎尖分生组织(shoot apical meristem,SAM)三个细胞层,由外而内为LⅠ-LⅡ-LⅢ,’T’代表LI起源于榨菜tubermustard,’C’代表LⅡ和LⅢ起源于紫甘蓝red cabbage]的茎段为外植体进行不定芽的诱导,并利用形态学特征和分子标记鉴定不定芽的细胞谱系。在添加不同浓度6-BA的MS诱导培养基中,从茎段基部直接再生的不定芽诱导频率随6-BA浓度的升高而增大。特异引物PCR以及简单重复序列标记显示不定芽起源于紫甘蓝谱系,即嵌合体SAM的LⅡ和/或LⅢ细胞层,命名为r-CCC(r=regenerated)。对r-CCC通过腋芽诱导进行无性繁殖,构建无性后代r-CCCn(n = generation)。再生的不定芽及其无性后代叶片光滑无表皮毛,叶脉处和茎为紫红色,在形态学上与紫甘蓝亲本相似,然而与对照材料相比表现出叶片蜡质含量明显减少的表型变异。扩增片段长度多态性分析结果显示,r-CCC中未出现榨菜亲本的特异条带,但与r-s-CCC(s=self-grafted)相比存在0.76%的差异条带,且差异位点主要分布于非编码的基因间区。(2)对r-CCC4和r-s-CCC4全基因组甲基化图谱分析发现,r-CCC4中CHH类型胞嘧啶的甲基化水平和比例均高于r-s-CCC4,并且在转座元件等重复序列上的CHH类型甲基化水平升高最为明显。对甲基化差异位点相关基因(DMG)的KEGG通路富集分析发现,13个DMGs参与蜡质合成Cutin,suberine and wax biosynthesis通路。通过重亚硫酸氢盐测序技术对基因LOC106335792,LOC106298662,LOC106311786和LOC106333935上差异位点的甲基化模式的验证结果与全基因组重亚硫酸氢盐甲基化测序数据一致。实时荧光定量PCR分析结果表明,差异基因在r-CCC4和r-s-CCC4中的转录水平不同,其中基因LOC106335792和LOC106311786在r-CCC4中的表达水平显著降低,可能为蜡质含量变异的候选基因。(3)对r-CCCn和r-s-CCCn中蜡质合成相关DMGs的甲基化模式分析发现,嫁接引起的甲基化模式变异能够在无性繁殖过程中稳定维持。对相关甲基化转移酶的转录水平分析结果表明,MET1在r-CCC2和r-CCC4的表达水平显著升高,推测其负责维持CG类型的DNA甲基化变异;而CMT3在r-CCCn中的表达水平均低于r-s-CCCn,可能参与维持CHG类型的甲基化变异。此外,对嵌合体花粉中的甲基化模式分析发现,DNA甲基化变异可以通过减数分裂进行传递。(4)以r-s-TTT,r-s-CCC和r-CCCn为材料,通过small RNA高通量测序分析异源嫁接对小RNA种类及表达量的影响。研究结果揭示,嵌合体无性后代中绝大多数siRNA的表达水平明显升高,并且与基因组重复序列相关小RNA的比例在无性后代中呈现逐渐升高的趋势。在多代无性材料中鉴定到1135种嫁接诱导的特异siRNA,包括159种榨菜亲本中的特异转录产物。此外,对miRNA的表达水平分析发现,22种novel miRNA的表达水平在r-s-CCC和r-CCCn中表现出显著差异,差异表达的novelmiRNA靶基因主要编码功能蛋白,包括锌指蛋白、ABC运载体以及与抗病性有关的TAO1蛋白等。此外,一种与光周期开花途径相关的已知miRNAbol-miR157a在r-CCCn中被显著抑制表达。(5)通过DNA甲基化和small RNA关联分析,发现65%的特异siRNA与重复元件相关,而且重复元件相关siRNA靶定区域的CHH类型胞嘧啶在嵌合体无性后代中表现为高甲基化修饰。异源嫁接诱导的转座元件相关siRNA能够在细胞再生和无性繁殖多代中稳定存在,推测这些siRNA可能参与维持基因组的稳定性,从而实现嫁接变异在后代的维持。