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有益微生物比如根际细菌对许多不同病原菌的抑制作用是众所周知的。在微生物中,芽孢杆菌由于其不同的产物表现出的拮抗作用受到广泛关注而成为研究的热门。本研究中命名为HAB-5的细菌菌株是从中国新疆的棉田土壤中分离得到。本研究阐明了该菌株及其抑菌活性分离物的特性,及其可能抗菌机制。我们已经鉴定出HAB-5的主要活性物质,纯化并描述了其主要活性物质的特性。我们还评估了其促进植物生长和控制作物病害的有效性,还优化了其产生主要活性物质的培养条件。我们应用模式生物斑马鱼从生态毒理学方面对其安全性进行了评估。所得结果总结如下:1.通过形态学和生理生化特性的鉴定,结合分子鉴定包括16SrRNA基因序列和特异性引物证实了该分离菌株HAB-5属于萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus。2.本研究评估了萎缩芽孢杆菌HAB-5菌株促进植物生长和控制病害的能力。结果表明,HAB-5具有促进植物生长的能力,并能产生1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶,在含有ACC的培养基中HAB-5菌株生长良好,但在没有ACC的培养基中没有生长;其能在Pikovskaya琼脂培养基上生长,表明其具有溶解不溶性磷酸盐的能力;基于FeCl3测试,HAB-5细胞滤液能产生橙褐色,显示出其具有噬铁能力;在添加有3%脱脂奶粉的LB琼脂平板中测试蛋白水解活性,HAB-5能产生明显的透明圈,显示有蛋白酶产生;HAB-5在羧甲基纤维素(CMC)琼脂培养基上生长,结果表明其具有纤维素酶活性。这些结果表明,萎缩芽孢杆菌HAB-5具有促进植物生长的特性,以及可能具有控制植物病原体的活性。3.使用不同的方案评估HAB-5菌株的抗真菌活性,结果表明,HAB-5对25种植物病原真菌具有广谱的抗真菌活性。对芒果炭疽病菌Cgloeosporioide.Penz MgCg-1的活性最佳佳为为67.233。然后是F.proliferatum A.alternata and B.cineria分别为62.87%,61.73%和55.10%。其次,分别用病原菌诱导和无病原菌诱导的含HAB-5分泌物的培养基测试对靶标菌的抑菌能力,结果显示出其对C.gloeosporioides生长具有良好抑制效果,分别为37.36%和39.31%。第三,HAB-5也能产生挥发性有机化合物(VOCs),能抑制A.alternata,F.oxysporum,P.nicotinae,C.gloeosporrioide和F.graminearum等病原真菌生长,抑菌效果分别为 74.41%,70.79%,51.30%,50.13%和 43.57%。此外,HAB-5 能够将生物活性物质从细胞质输出到细胞外环境,来自不同培养基的细胞滤液均具有很强的抗真菌活性。4.采用液-液萃取方案从石油醚提取物中收获HAB-5的生物活性抗真菌代谢物,获得粗提物,该粗提物对C.gloeosporioides有抑菌活性,抑菌圈达到27.13±1.25 mm,能造成 C.gloeosporioides 的菌丝形态异常。5.为了纯化生物活性化合物,使用柱色谱法对粗提取物进行不同的分离。获得两种主要的生物活性馏分。对馏分Ⅰ进行Gaz色谱/质谱(GC-MS)分析,我们确定了 19种挥发性有机化合物,包括1种酯,2种醇,2种烯烃,8种烷烃和6种有机酸。有趣的是,我们发现这些有机化合物可以单独或合作完成其抗真菌活性,而且它们之间存在协同效应以实现对病害的控制。相反,一些化合物具有不相容的关系,它们的混合物消除了它们的抑制作用。此外,我们还发现萎缩芽孢杆菌HAB-5能够产生完全拮抗所有测试真菌病原体的化合物。这一发现对于理解拮抗生物控制病原体生长的机理提供了一些启示。6.在液相色谱/质谱(LC-MS)中分析部分纯化的馏分Ⅱ。结果表明其含有枯草菌素和抗霉枯草菌素的脂肽。从萎缩芽孢杆菌HAB-5的基因组DNA克隆得到了脂肽生物合成基因,如BAC,ituC,FenB,mycB,ituA和lpa等6个基因。7.HAB-5粗提物具有热稳定性。随着温度升高至100℃,活性急剧增加,并且在120℃下高压灭菌20 min,活性更好。pH测试显示粗提物在5.0-10.0的pH范围内展现出活性,最佳为7.0。然而,该活性在pH值低于5.0和高于10.0显著降低。经过不同的蛋白水解酶处理后,抗真菌代谢产物依然稳定。MIC(最小抑制浓度)测定显示,对C.gloeosporioides、P.nicotinae 和 A.solani的 MIC 值最低,分别是 34 μg/mL、42 μg/mL 和 55 μg/mL;对 B.cinerea和F.oxysporum,MIC 分别为 67 μg/mL 和 76 μg/mL;对 F.gramirearum 和 P.theaefolia,MIC 分别为201 μg/mL和229 μg/mL。该粗提物的IC50为148.57 μg/mL。这些结果表明HAB-5具有强抗真菌活性。8.使用不同的发酵条件研究了 HAB-5菌株产生抗真菌产物的优化条件。结果如下:Luria Bertani和Mueller Hinton培养基产量最高,孵育期为48小时,温度和pH分别为28℃和6.50-7.0,接种量为2%,摇床转速为180rpm;碳源(葡萄糖)和氮源是影响HAB-5菌株产生抗菌物质的主要因子。9.HAB-5细胞悬浮液具有较好的促生作用。在培养基上,1×1O7cfu/mL细菌细胞悬液处理的番茄种子萌发率增加了 48%,与对照组相比,侧根根系明显增多,同浓度本氏烟根长增加54.71%。还观察到,HAB-5的VOCs增加了烟草植物鲜重4.01倍。60天后,处理与未接种相比,在苗的鲜重和干重、根的鲜重和干重方面,HAB-5处理的植株分别增加76.47%,80.58%,71.71%和82.10%。接种的植株明显比非接种植株高出45.76%,并且叶片显示出更绿。通过分析烟草叶片中NtEXP1,NtEXP2和NtEXP6基因的表达,再次确认了 HAB-5可以诱导这些基因的表达。在盆栽试验条件下,HAB-5菌株能成功地在烟草根际生长繁殖。10.HAB-5菌株1×107cfu/mL细菌悬液能诱导烟草抗病性,保护植物免受烟草花叶病毒(TMV)和烟草疫霉侵染。在HAB-5抑制烟草疫霉试验中,30天后HAB-5能使烟草叶片中脯氨酸、H2O2、NO和叶绿素含量保持较高水平,MDA含量保持在较低水平,并上调了 NtEXP2,NPR1,in1防御和生长促进相关基因的表达。11.HAB-5菌株1mg/mL的粗提物能有效降低了芒果果实上炭疽病、烟草疫霉病和烟草病毒病(TMV)的严重程度。此外,发现在用粗提物处理的植物中信号调节基因(NPR1),防御基因(PR-1a,PR-1b,Chia5)和过敏性细胞坏死基因(Hsr203J,Hin1)上调。HAB-5的挥发性有机化合物也能显着降低了灰霉病菌对番茄果实的致病性。12.将斑马鱼胚胎受精后24h(hpf)至96 hpf暴露于不同浓度(49.20,61.40,72.80,96.00mg/L 和 120mg/mL)HAB-5 菌株的粗提物,检测其粗提物安全性。结果表明,处理的胚胎D.Rerio LC50值为103.92mg/L,95%可信区间为89.79-130.58 mg/L,与对照相比,运动和心脏节律没有显着差异。HAB-5粗提物没有导致斑马鱼孵化时间减少,但对96 hpf 120 mg/mL暴露的斑马鱼最终孵化率有轻微影响。此外,所有暴露的胚胎在72小时内完全发育而没有畸形,在最高暴露浓度96 hpf时,引起初孵幼鱼轻微的发育异常,但粗提物未造成斑马鱼死亡。总体结果表明了 HAB-5菌株非常优质、安全、高效、环保,有广阔的应用前景。