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研究背景骨肉瘤是最常见的起源于骨骼系统的原发性恶性骨肿瘤,特点是高发生率,高度恶性,高转移率,因此预后较差,肿瘤的发生给患者家庭和社会带来了很大的花费和负担。近20年以来,尽管国际诸多研究机构进行了大量的努力,但骨肉瘤患者生存率依然停滞不前,仿佛进入了骨肉瘤治疗的瓶颈期。同时化疗耐药的出现也让化疗方案的推广举步维艰,激进的化疗方案的副作用让很多骨肉瘤患者难以坚持完成治疗。为此,对骨肉瘤的深入研究迫在眉睫。近年来有关微小RNA(microRNA,miRNA)的研究成为肿瘤领域研究的热点。在人类多种癌细胞中都发现了miRNA的表达异常,miRNA既可以促进肿瘤生长而起到癌基因的作用,也可抑制肿瘤生长而起到抑癌基因的作用。最近的研究提示miR-143参与了肿瘤细胞的发生、增殖、分化、迁移侵袭、凋亡等生理过程,但总体而言miR-143的作用主要起到类似抑癌基因的功能。然而,针对miR-143的研究大多集中于上皮组织来源的癌细胞,对于间叶源性的恶性肿瘤细胞尤其是骨肉瘤中miR-143的作用报道较少。我们在本研究通过检测骨肉瘤组织和邻近正常组织中miR-143的表达,并通过生物信息学技术预测靶基因后检测靶基因的表达情况。通过细胞转染上调miR-143及特异性抑制序列来敲除miR-143的作用,观察体外培养的骨肉瘤细胞系中靶基因的表达情况,并检测miR-143对骨肉瘤细胞凋亡的影响,以期阐明miR-143在骨肉瘤中的作用,为靶向治疗骨肉瘤提供可能的思路。研究目的1.观察miR-143在骨肉瘤组织中的表达水平。2.观察miR-143对骨肉瘤细胞的影响。3.寻找miR-143的靶基因,阐明miR-143对靶基因的调节作用。研究方法1.收集骨肉瘤病人的标本,应用RT-PCR技术检测骨肉瘤标本及周围正常组织中miR-143的表达水平,比较miR-143在骨肉瘤和正常组织中的表达差异。2.通过生物信息学方法及软件预测miR-143的靶基因为Bcl-2,RT-PCR技术检测骨肉瘤标本及周围正常组织中Bcl-2的mRNA表达水平,应用免疫组织化学技术和Western Blot方法检测骨肉瘤标本及周围正常组织中Bcl-2的蛋白表达水平。3.利用脂质体2000将miR-143模拟物及阴性对照序列瞬时转染MG63骨肉瘤细胞系,建立过表达miR-143的骨肉瘤细胞系。4.利用CCK-8检测不同时间段过表达miR-143的骨肉瘤细胞系及阴性对照组细胞的细胞活性,观察miR-143对骨肉瘤细胞增殖能力的影响。5.利用Transwell方法检测不同时间段过表达miR-143的骨肉瘤细胞系及阴性对照组细胞的细胞穿膜数量,观察miR-143对骨肉瘤细胞迁移能力的影响。6.预测miR-143的靶基因,并构建相应靶基因的野生型和突变型荧光素酶报告基因质粒,与miR-143模拟物及阴性对照共转染MG63骨肉瘤细胞,检测荧光素酶活性,判断miR-143的靶基因。7.转染miR-143模拟物及抑制物后通过RT-PCR和Western Blot技术检测靶基因的mRNA水平和蛋白表达水平的变化,分析miR-143对靶基因的调节作用。8.将miR-143模拟物及阴性对照序列转染MG63骨肉瘤细胞系后,应用Annexin V/PI双染色后通过流式细胞术检测细胞凋亡比率的变化,来观察miR-143对骨肉瘤细胞凋亡的影响。实验结果1.12例骨肉瘤标本中的miR-143表达水平同邻近正常组织中相比明显下降,只有邻近正常组织的56%。2.通过TargetScan软件预测miR-143的靶基因可能是Bcl-2。免疫组织化学方法发现骨肉瘤标本中的Bcl-2表达水平较正常组织相比明显升高。RT-PCR检测发现Bcl-2的mRNA表达水平较正常组织明显升高,Western Blot结果显示骨肉瘤组织中Bcl-2的蛋白表达水平明显增加,约为邻近正常组织的1.9倍。3.通过细胞转染的方法成功建立miR-143高表达的骨肉瘤细胞系。4.转染miR-143 48h及72h时,骨肉瘤细胞活性明显下降,分别为对照组的78.6%和65.4%。miR-143能够抑制骨肉瘤细胞的增殖。5.转染miR-143 72h时,骨肉瘤细胞的穿出Transwell小室的细胞数量明显减少。miR-143能够抑制骨肉瘤细胞的迁移能力。6.成功构建候选靶基因Bcl-2的荧光素酶报告基因质粒,共转染miR-143和Bcl-2报告基因后荧光素酶失活,证实Bcl-2是miR-143的靶基因。7.过表达miR-143的骨肉瘤细胞中,Bcl-2的mRNA明显下调,蛋白表达水平明显降低,而应用miR-143抑制物可上调Bcl-2的蛋白表达。miR-143通过抑制Bcl-2表达发挥作用。8.过表达miR-143明显增加骨肉瘤细胞凋亡比率,其机制可能与miR-143介导的Bcl-2下调有关。结论1.骨肉瘤组织中miR-143的表达降低,而Bcl-2的表达水平增高。2.过表达miR-143能够抑制骨肉瘤细胞的增殖与迁移。3.Bcl-2可能是miR-143的靶基因之一,miR-143可介导Bcl-2的表达水平。4.miR-143可诱导骨肉瘤细胞凋亡,其机制可能与miR-143介导的Bcl-2下调有关。