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血管损伤后,血管内膜的内皮细胞(endothelial cells,ECs)被破坏,位于血管中膜的平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)暴露并出现增殖、迁移、自噬、凋亡等功能变化,形成了新生内膜,然而,内膜损伤过程中VSMCs功能异常的分子机理目前尚不清楚。已有研究表明,血管损伤后,血小板可以被激活并释放血小板微体(platelet microparticles,PMPs),通过小RNA(microRNAs,miRs)等内含物参与细胞间的信息交流。miRs作为内源性的具有调控作用的单链非编码RNA在多种生命活动中有着至关重要的调控作用,本文探讨了PMPs携带的miRs在内膜损伤VSMCs增殖、凋亡和自噬中的作用及其可能分子机制。本文构建了大鼠颈动脉内膜损伤模型,以自身对侧动脉为对照,应用HE、免疫荧光染色,检测损伤血管形态以及血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)、CD41和平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达;基于实验室前期的miRs芯片测序结果,筛选高表达的miRs;荧光原位杂交检测血小板内高表达的miRs在损伤血管内的表达位置及水平;RT-PCR用于检测PMPs刺激后VSMCs中血小板内高表达的miRs的表达水平。对于上述实验筛选得到的miR-92a-3p和miR-30,生物信息学软件结合双荧光素酶检测其靶基因;miRs mimics或inhibitor用于上调或下调VSMCs内miR-92a-3p或miR-30的表达,siRNA用于抑制VSMCs内靶基因表达;蛋白免疫印迹法检测VSMCs中靶基因和自噬相关分子的蛋白表达水平;Annexin V/PI结合流式细胞术检测VSMCs的凋亡水平;BrdU ELISA检测VSMCs的增殖水平。应用FX-5000T张应变加载系统,对体外培养的VSMCs施加5%幅度生理性张应变和15%幅度高张应变,应用流式细胞术检测PMPs与VSMCs的黏附;细胞免疫荧光检测VSMCs中自噬微管相关蛋白轻链3(autophagy microtubule associated protein light chain 3,LC3)的表达。研究结果显示:(1)损伤内膜局部有血小板聚集并出现VSMCs异常增殖:HE及免疫荧光显示损伤4周后血管发生显著的内膜新生,增生的细胞基本为VSMCs,同时,损伤局部有血小板黏附到暴露的VSMCs上。(2)PMPs通过miR-92a-3p/十号染色体缺失的磷酸和张力同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)信号通路调控VSMCs增殖:血小板miRs芯片结果显示,miR-92a-3p在血小板中表达丰度很高,荧光原位杂交结果证实这一高表达的miR在新生内膜中的VSMCs表达高于自体对照的正常动脉。体外细胞实验中上调、下调miR-92a-3p结合双荧光素酶实验证实,miR-92a-3p的靶基因是PTEN,可以负向调控其表达。BrdU ELISA检测到上调miR-92a-3p能显著促进VSMCs增殖。(3)PMPs通过miR-30/Runt相关转录因子2(runt related transcription factor 2,Runx2)信号通路调控VSMCs凋亡:Annexin V/PI流式细胞术检测到PMPs刺激VSMCs 24 h后,VSMCs凋亡显著上升。血小板miRs芯片结果显示,miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p、miR-30e-5p在血小板中表达丰度都很高,且RT-PCR检测到PMPs刺激后VSMCs中的miR-30a-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p、miR-30e-5p表达显著升高。体外细胞实验中上调miR-30c-5p、miR-30e-5p能够显著促进VSMCs凋亡。生物信息学软件依据结合位点预测到miR-30的下游调控靶基因Runx2,并且PMPs刺激和上调miR-30e-5p都能够抑制miR-30潜在靶基因Runx2的表达,双荧光素酶报告基因实验证实,miR-30e-5p直接靶向Runx2。此外,Runx2 siRNA下调Runx2能显著促进VSMCs凋亡。(4)PMPs促进VSMCs自噬:与5%生理性张应变加载相比,15%高张应变加载24 h后,VSMCs对PMPs黏附水平显著增强;蛋白免疫印迹结合细胞免疫荧光结果显示,PMPs刺激VSMCs 24 h后能显著上调自噬相关蛋白(autophagy related protein,ATG)5、ATG7、ATG12及LC3的表达。我们的研究揭示,PMPs刺激上调VSMCs中miR-92a-3p和miR-30e-5p的表达,通过miR-92a-3p/PTEN信号通路促进VSMCs增殖,通过miR-30e-5p/Runx2信号通路促进VSMCs凋亡,并且高张应变加载显著增强VSMCs与PMPs的黏附,且PMPs能够上调VSMCs自噬。本研究提示PMPs及其包含的miRs在血小板与VSMCs细胞间信息交流过程中起重要作用,为寻找内膜损伤血管重建疾病诊断、临床治疗和疗效评价的潜在靶点提供了新角度。