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抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是机体先天免疫系统的重要组成部分,对细菌,真菌和病毒等病原体具有广泛的抑制作用。贝类是一种滤食性的水生生物,时刻面临着水体中大量微生物的侵袭,因此,贝类已进化出一套有效的先天免疫系统,特别是依靠其抗菌肽进行免疫防御。马氏珠母贝是一种具有重要经济价值的珍珠贝,但是目前在马氏珠母贝中尚未发现有代表性的抗菌肽分子,这意味着马氏珠母贝可能依靠其他的免疫效应分子来进行免疫防御。为了进一步探究马氏珠母贝抵抗环境病原体的分子机理,本研究基于马氏珠母贝基因组数据库,从基因层面出发,筛选马氏珠母贝免疫效应分子并进行克隆,分析免疫效应分子在病原体相关分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMPs)刺激后的组织表达情况,构建原核表达载体,对重组蛋白开展抗菌机制研究。结果如下:(1)免疫效应分子的筛选与克隆:利用在线Antimicrobial peptide database(APD)的抗菌肽氨基酸序列构建本地数据库,与马氏珠母贝基因组比对,成功筛选出4种免疫效应分子并克隆获得c DNA全长,分别为马氏珠母贝胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(trypsin-like serine protease,PmTLS)c DNA全长778 bp,马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂(Kunitz-type serine protease inhibitor,PmKuPI)c DNA全长为1318 bp,马氏珠母贝鹅型溶菌酶(goose-type lysozyme,Pmlys G)c DNA全长为973 bp,马氏珠母贝鞘脂蛋白(saposin B,PmSap B)c DNA全长为1148 bp。同源性分析,PmTLS、PmKuPI和PmSap B的物种间相似性较低,而Pmlys G的物种相似性较高,与海湾扇贝的相似性达到60.5%。进化树分析发现PmTLS与长牡蛎的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶亲缘关系最近,PmKuPI与长牡蛎和美洲牡蛎的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂亲缘关系最近,Pmlys G与海湾扇贝、栉孔扇贝和虾夷扇贝的鹅型溶菌酶亲缘关系最近,PmSap B与美洲牡蛎的鞘脂蛋白亲缘关系最近。(2)组织表达及PAMPs刺激后特定组织表达分析:利用实时荧光定量PCR技术检测四种免疫效应分子在马氏珠母贝常规组织的表达模式,发现PmTLS在血细胞中表达量最高,PmKuPI在外套膜中高表达,Pmlys G和PmSap B在肝胰腺高表达,三种高表达组织均为免疫相关组织。相比对照组,在LPS、PGN和Poly I:C刺激马氏珠母贝后,PmTLS在血细胞的表达量有所上升,并都在48 h时达到最大值(P<0.05);LPS和Poly I:C刺激马氏珠母贝后,Pmlys G在肝胰腺的表达量都在72 h达到最大值(P<0.01),PGN刺激后,Pmlys G在肝胰腺的表达量在6 h就达到最大表达水平(P<0.01);同样,LPS和Poly I:C分别刺激后,PmSap B在肝胰腺的表达量都在72 h达到最大值(P<0.01),PGN刺激后,PmSap B在肝胰腺的表达量在24 h达到最大表达水平(P<0.05)。(3)四种免疫效应分子的原核表达:成功构建了pET28-PmTLS、pET28-PmKuPI、pET28-Pmlys G和pET28-PmSap B四个原核表达载体,优化表达条件,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组蛋白r PmTLS、r PmKuPI、r Pmlys G和r PmSap B。在0.5 m M的IPTG诱导下,pET28-PmTLS的最佳诱导温度是37℃,其余三个表达载体的最佳诱导温度是15℃。经纯化复性后,最终获得r PmTLS8.02 mg,r PmKuPI 11.27 mg,r Pmlys G 16.96 mg,r PmSap B 4.57 mg。(4)PmTLS和PmKuPI(rPmTLS和rPmKuPI)的抗菌功能研究:利用细菌生长曲线抑制法检测r PmTLS和r PmKuPI的抗菌活性,在所检测的8种细菌中,r PmTLS蛋白显著抑制了4种革兰氏阴性菌的生长(p<0.05),分别是铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌,r PmKuPI蛋白显著抑制了5种革兰氏阴性菌种的生长(p<0.05),分别是大肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌。利用透射电子显微镜观察两个重组蛋白作用后细菌的形态学变化,发现r PmTLS作用于铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌后,相比对照组,铜绿假单胞菌的菌体膨胀,出现质壁分离的现象;嗜水气单胞菌内含物质部分丢失,内部结构发生变化,细胞壁出现溶解;副溶血弧菌内含物缺失,菌体中间膨胀,出现质壁分离的现象。r PmKuPI作用于铜绿假单胞菌和副溶血弧菌后,与对照组相比,铜绿假单胞菌内含物质缺失,内部结构发生明显改变,菌体一端也有内含物质释放出来;副溶血弧菌内含物收缩,与细胞壁基本脱离,并且有明显的折皱和缺失。本研究为探讨马氏珠母贝免疫效应分子的作用机制提供初步参考,对贝类抵抗环境病原体的机制有进一步的认知,也为替代抗生素在水产养殖中的滥用提供可能。