研究背景氨苯砜,化学名称为二氨基二苯砜(4,4’-diaminodiphenylsulfone),是一种砜类化合物,发明初期仅作为一种化学物质应用于德国的染料工业。1937年起,科学家们开始对砜类进行医学研究。1949年,应用口服氨苯砜治疗麻风被首次报道。随后,氨苯砜作为联合化疗中的其中一种主要药物,被用于在全世界范围内麻风的治疗。因其同时具有抗感染和抗炎两种特性,氨苯砜被广泛应用于疟疾、艾滋病患者的卡氏肺囊虫肺炎等感染性疾病及多种慢性炎症性皮肤病如疱疹样皮炎、线状IgA大疱性皮病、大疱性类天疱疮、天疱疮、色素性痒疹、持久隆起性红斑、白细胞碎裂性血管炎、坏疽性脓皮病等以及若干种皮肤科以外的疾病如类风湿性关节炎、嗜酸性筋膜炎、免疫性血小板减少症、支气管哮喘、中风、脑胶质瘤以及癫痫等的治疗。氨苯砜的副作用可以影响血液系统,皮肤,中枢神经系统,胃肠道,肝脏,神经肌肉和眼等器官。氨苯砜综合征是氨苯砜引起的最严重的副作用,是服用氨苯砜后导致的罕见的、严重的药物不良反应,通常在服用氨苯砜3-6周后出现,临床表现包括突然发生的皮疹,伴有发热、淋巴结肿大和系统受累(包括肝脏、肾脏、血液系统等)。本病的总发病率约1.4%,中国麻风患者发病率约1.5%,死亡率9.6%。目前关于氨苯砜综合征的诊断,大部分学者都采用Richardus和Smith于1989年提出的诊断标准,即患者在应用氨苯砜以后出现皮疹、发热、肝功能异常及淋巴结肿大中的2条或2条以上,并排除导致类似临床表现的其他药物或疾病的可能后即可诊断。近年来药物遗传学飞速发展,部分研究成果已经在临床实践领域应用,并将在未来几年变得越来越重要。最近,科学家们广泛采用候选基因法和全基因组关联分析(Genome wide association study,GWAS)方法来探索特定药物所致重症药物不良反应的风险位点,发现许多遗传异质性重症药物不良反应与人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因之间具有显著相关性。因为HLA分子需要识别数量巨大、形式多样的内源性和外源性多肽,所以HLA基因非常多且极具多态性,涉及与药物抗原之间高度可变的相互作用。在携带特异性HLA等位基因的个体中,免疫应答可能被特定的药物抗原所触发,导致药物特异性的T细胞激活和克隆扩增。例如,HLA-B*57:01是阿巴卡韦综合征发病的风险因子,HLA-B*15:02和HLA-A*31:01与卡马西平诱导的Stevens-Johnson综合征具有强相关性。国际权威的一些相关治疗指南大都推荐,在服用别嘌呤醇和卡马西平之前进行HLA-B*58:01和HLA-B*15:02等位基因(亚裔人群)的检测来判断受试者是否属于高危人群,如果属于高危人群则不服药,以有效降低由别嘌呤醇或卡马西平引起的严重不良反应的发生率。主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)区域以外也存在许多基因参与药物不良反应的发病机制。例如,ST6GAL1是氟氯西林导致的肝脏损伤性疾病除HLA-B*57:01之外的易感因子;CFLAR参与别嘌呤醇导致的重症皮肤药物不良反应;TNF和HSP70基因与卡马西平导致的药物不良反应相关;SLCO1B1与辛伐他汀导致的肌肉毒性有强相关性。2013年,我们团队通过全基因组关联分析结合目标区域测序的技术,发现HLA-B*13:01与氨苯砜综合征的发病强相关。通过该位点预测氨苯砜综合征的发病,敏感性和特异性分别为85.5%和85.7%。该生物学标记的阴性预测值达99.8%,而阳性预测值仅7.8%。这意味着HLA-B*13:01阳性个体中只有7.8%的患者服用氨苯砜后会发生氨苯砜综合征。低阳性预测值提示仅将HLA-B*13:01位点作为疗前检测指标来预防氨苯砜综合征的发生,其效益成本比可能不高。低阳性预测值也提示除HLA-B*13:01之外,其他遗传因素或环境因素也影响氨苯砜综合征的发生。另外,HLA-B*13:01具有种族异质性,它是亚洲人群的一个特异性位点,在欧洲和非洲种群中罕见。因此,在HLA区域或者非MHC区域中的其他基因中可能存在除HLA-B*13:01之外的其他基因突变与氨苯砜综合征相关。此外,HLA等位基因数据库(IPD-IMGT/HLA)中显示,根据HLA-B基因上2,3,4号外显子上的不同变异,HLA-B*13:01在六等位水平存在12种不同亚型。因此,我们也猜测氨苯砜综合征患者中HLA-B*13:01可能存在特殊的六等位亚型。本研究分为两大部分,第一部分我们应用以第二代测序技术为基础的HLA分型方法,探寻HLA区域中与氨苯砜综合征相关的除HLA-B*13:01之外的其他基因突变,并同时探索氨苯砜综合征患者中是否存在特殊的六等位亚型。第二部分我们应用GWAS手段,探究非MHC区域中是否存在与氨苯砜综合征相关的基因多态性。第一部分HLA基因多态性与氨苯砜综合征的相关性研究目的本研究旨在发现HLA区域中与氨苯砜综合征相关的除HLA-B*13:01之外的其他基因突变,并探索氨苯砜综合征患者中是否存在特殊的六等位亚型。方法本研究为病例对照研究,所有研究对象均为HLA-B*13:01阳性的中国麻风患者,于2009年至2017年通过中国省-市-县级麻风防治网络体系进行招募。病例为HLA-B*13:01阳性的103例氨苯砜综合征患者,他们应用含氨苯砜的联合化疗治疗麻风后发病。氨苯砜综合征的诊断标准采用校正后的Richardus&Smith诊断标准:(1)在服用氨苯砜后出现皮疹、发热、肝功能异常及淋巴结肿大中的2条或2条以上;(2)临床表现与服用氨苯砜有关,临床症状在停用药物之后好转;(3)临床症状不与除氨苯砜之外的其他药物有关;(4)排除有相似临床表现的其他疾病。对照为857例HLA-B*13:01阳性,但应用含氨苯砜的联合化疗方案治疗麻风至少6个月以上,仍没有发生任何药物不良反应的个体。提取研究对象的基因组DNA,应用Taqman实时定量PCR方法确定所有实验对象均在四等位水平携带HLA-B*13:01等位基因。采用第二代测序技术对HLA-A,-B和-C,HLA-DRB1和-DQB1进行高分辨率HLA等位基因分型。根据样本量的大小,进行统计学效能计算,将最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)≥15%的常见变异纳入分析。用Fisher’s精确检验比较病例与对照组间携带基因变异的比例。根据纳入分析的变异数量进行Bonferroni校正。统计学分析应用R软件和SPSS软件。结果我们总结了 103例氨苯砜综合征患者的临床特点。共有409个氨基酸变异和167个经典四等位HLA等位基因被进行分型。经过统计效能计算,发现本研究的样本量的统计效能只足够分析MAF≥15%的常见变异。将MAF≥15%的138个HLA变异,包括130个氨基酸变异及8个HLA等位基因纳入氨苯砜综合征的关联分析中。Bonferroni校正后,我们发现5个位于HLA-DRB1的氨基酸变异(位置:133,142,-17,11,13)与氨苯砜综合征的易感性相关。这5个显著相关的氨基酸变异处于很强的连锁不平衡。这5个显著相关的氨基酸变异标记的HLA位点为HLA-DRB1*16:02和DRB1*15:01,它们在病例组的携带频率高于对照组。四等位水平的HLA位点中,共有HLA-DRB1*16:02,-DRB1*15:01和-A*24:02与氨苯砜综合征的易感性之间具有名义上的显著相关性,Bonferroni校正后,这些位点的频率在病例-对照组间的差异无统计学意义。根据氨苯砜综合征的临床表现,我们将具有全部四种主要症状(高热、皮疹、淋巴结肿大和肝脏功能异常)的病例归组为完全型氨苯砜综合征病例组,其他只具有这四种主要症状中2-3种的病例归类为不完全型氨苯砜综合征病例组。根据潜伏期的长短,将病例分为长潜伏期组(潜伏期>28天)和短潜伏期组(潜伏期≤28天)。我们分别比较138个HAL变异在完全型病例组与不完全型病例组之间,以及长潜伏期组与短潜伏期组之间的基因频率的差异;没有发现任何变异与氨苯砜综合征的完全型/不完全型或者潜伏期的长短具有相关性。HLA-B*13:01在六等位上有12种不同的亚型,它们在HLA-B基因的2,3,4号外显子上存在不同的突变。我们发现病例组和对照组均在六等位上携带的是HLA-B*13:01:01,没有发现其他六等位亚型。结论我们的研究发现HLA-DRB1上的5个强连锁不平衡的氨基酸变异是氨苯砜综合征除HLA-B*13:01之外的风险因子。携带HLA-B*13:01的氨苯砜综合征病例与耐受对照的HLA-B*13:01六等位亚型均为HLA-B*13:01:01,说明HLA-B*13:01的六等位没有影响氨苯砜综合征在中国种群中的关联模式。将来还需要在更多不同种群中进行研究来证实现在的发现,以及探索是否在非MHC区域存在氨苯砜综合征的风险因子。第二部分非MHC区域基因多态性与氨苯砜综合征的相关性研究目的本研究旨在探索非MHC区域基因多态性与氨苯砜综合征的关联性。方法我们对中国种群的氨苯砜综合征进行了两阶段的GWAS,分为发现阶段和验证阶段。所有研究对象均为中国麻风患者。病例为应用含氨苯砜的联合化疗治疗麻风后发生氨苯砜综合征的患者。病例的诊断符合校正后的Richardus&Smith诊断标准。对照为应用含氨苯砜的联合化疗方案治疗麻风至少6个月以上仍没有发生任何药物不良反应的个体。发现阶段包括已报道的GWAS数据库中的39例病例和88例对照,以及新招募的12个病例和130例对照。验证阶段包括62例病例和319例对照。发现阶段应用Illumina Omni Zhonghua芯片进行分型,对样本和SNPs进行质量控制后,单倍型构建由SHAPEI软件完成,基因差补计算由IMPUTE软件完成。验证阶段在Sequenom MassARRAY平台进行SNPs的分型。统计学分析软件应用SNPTEST和PLINK软件。结果我们首先分析了 Illumina Omni Zhonghua芯片中分型的51例病例和218例对照。质量控制之后,共有258,961个重叠的SNPs最终被纳入到全基因组关联分析中。基因差补计算与质量控制后,应用log-additive test检验了一共3,574,594个位于MHC区域之外的SNPs。其中,41个MHC以外的区域显示与氨苯砜综合征有提示性关联(P<1.0 × 10-4),将这41个区域中显示提示性关联的SNPs纳入到验证分析中。验证分析阶段包括62例病例和319例对照。共有19个候选SNPs成功分型。这19个位于非MHC区域的SNPs在验证阶段都没有显示与氨苯砜综合征存在显著相关性。其中18个SNPs(除rs75252193)在合并分析中显示与氨苯砜综合征有名义上显著的关联性。结论本次研究在中国种群中没有发现任何非MHC区域上的SNPs与氨苯砜综合征的关联性达到全基因组显著性水平。