论文部分内容阅读
PPR基因家族在植物生长发育过程中至关重要，参与质体基因转录后加工、调控细胞质雄性不育基因的表达、调控胚胎发育等。番茄与烟草基因组计划的完成，为其PPR基因家族的全基因组鉴定奠定了基础。细胞质雄性不育恢复基因（Rf）除个别外均编码PPR蛋白，是PPR基因家族的成员。在农业生产中，多利用雄性不育系生产烟草杂交种。但是，目前尚未在普通烟草中发现不育系的恢复系，也未见有烟草雄性不育/恢复作用机理的相关研究报道。本研究分析了番茄和绒毛状烟草PPR基因家族，克隆了绒毛状烟草中的Rf相关基因，不仅对其进行了在不同品种不育系中的过表达分析，还对K326进行了RNAi研究，探讨其与烟草雄性不育发生的关系，为烟草雄性不育/恢复机理的研究提供参考。获得的主要结果如下：（1）在番茄基因组鉴定了471个PPR编码基因。根据保守结构域将其分为P和PLS亚家族，各占序列数目的一半；PLS亚家族又分为PLS、E、E+和DYW四类。该基因家族分布在番茄12条染色体上，其中约60%的基因无内含子结构，平均每个基因含有1.03个内含子；约70%的PPR基因具有RNA结合活性。（2）在绒毛状烟草基因组鉴定了487个PPR编码基因，其中P和PLS亚家族各264和223条，PLS亚家族包含PLS、E、E+和DYW四个亚类型各22、76、56和69条序列；各个结构域高度保守，与番茄相比，S结构域的变异率最小，为12.9%，E+结构域最大，为29.0%。该基因家族较均匀的分布在绒毛状烟草12条染色体上，其中61%的基因无内含子结构，平均每个基因含有内含子个数为1.2个；74%的PPR基因具有RNA结合活性。（3）从绒毛状烟草基因组克隆了6条Rf基因相关序列，命名为NtomRf1~6，GenBank编号分别为KF770956~KF770961。其中，NtomRf2和NtomRf6存在碱基删除突变；其它4条为完整读码框，但NtomRf5包含3个PPR结构域缺失，且其在不育系MS K326中存在C/A颠换和T缺失突变，导致3’非编码区通读。NtomRf1、3、4、5均编码含有10~13个PPR结构域的PPR蛋白，定位于线粒体。6条Rf序列在检测的组织中均有表达，但存在表达偏好；其在MS K326中的表达量高于其保持系K326。（4）选择基因NtomRf4和NtomRf5构建了过表达载体，并分别转化不同烟草品种的不育系，其转基因植株阳性率为66.3%。NtomRf4和NtomRf5基因在过表达阳性植株不同组织中的表达量提高了1.9~3.7倍，但是却均不能使MS K326等不育系的雄蕊正常发育，也即不能使其恢复育性。说明MS K326及其他烟草不育系品种不育性发生的机制非常复杂，不能为单一Rf基因恢复。（5）构建了NtomRf4和NtomRf5基因特异序列的干扰载体，转化K326得到转基因植株的阳性率为100%。NtomRf4和NtomRf5基因在RNAi K326阳性植株中的表达量下降了57.1%~85.3%，但仍有可检测的表达量，可能是其花器官和雄蕊发育正常，且能产生花粉的原因之一。下一步收获T1代种子后，进行发芽实验，观察其发芽率是否降低或者T1代植株是否不育。