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随着我国人民生活水平的提高和社会老龄化,冠心病(coronaryheartdisease,CHD)的发病率和死亡率呈上升趋势。如何降低CHD的发病率和死亡率成为公共卫生和临床医学必须解决的一个重大问题。CHD是一种多基因、多步骤的疾病。各种研究表明,热休克蛋白60(heatshcokprotein60,HSP60)抗原和抗体通过炎症及免疫反应在CHD的发生和发展过程中起非常重要的作用。
Hsp60是一种线粒体分子伴侣,在应激条件下表现出诱导性合成,保护细胞免受各种应激的损伤。很多已知的CHD危险因素(氧化的低密度脂蛋白、高血压、感染、氧化损伤等)可刺激血管内皮细胞、平滑肌细胞表达Hsp60,由于人和微生物Hsp60在氨基酸序列上有50-70%的同源性,针对于微生物Hsp60的免疫反应可能和自身的Hsp60抗原发生交叉反应,导致血管内皮的损伤。
Hsp60表达量或表达亚型上的变化,可以改变Hsp60的抗原性及机体对应激因素的耐受性,进而影响个体对CHD的易感性。目前的研究表明编码区及调控区的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)可能改变蛋白质表达的量或亚型,但很少有人研究hsp60SNPs意义及其在CHD发生和发展过程中的作用。
不同人种SNPs类型和频率不同,美国国立生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)和欧洲生物信息学研究所(EuropeanBioinformaticsInstitute,EBI)等公共数据库收录了60多个hsp60SNPs,其中6个为导致氨基酸改变的错义SNPs,但这些SNPs缺乏频率和人种信息。在中国汉族人群中进行hsp60SNPs与CHD关联研究必须首先明确hsp60SNPs在中国汉族人群中的种类、频率和分布规律。
对中国汉族人群hsp60再测序,是解决上述问题的最佳方法。因此本研究通过hsp60再测序,找出中国汉族人中常见的SNPs,并从中选择有代表性的SNPs,采用病例对照研究分析hsp60基因多态性与冠心病的关系。
第一部分hsp60基因多态性在中国汉族人群中的分布
本部分应用分片段扩增直接测序结合Taqman基因分型技术,检测30名健康志愿者的hsp60基因5侧翼区、全部编码区、内含子外显子交界区序列,比较检测结果和NCBI和EBI数据库中的相应数据,确定中国汉族人群hsp60基因SNPs的位置、类型和频率。
结果显示:1、研究人群中频率大于1%的hsp60SNPs共13个,其中4个为新发现SNPs。4个新SNPs分别是:位于2号染色体198189061的a/g(外显子2),198184890a/g(外显子5),198184774ag/--(内含子5),198180643ac/--(内含子7),杂合度分别为0.06、0.04、0.5、0.5;9个已报道的SNPs分别为rs1116734g/c,rs3749095c/t,rs1050347t/c,rs8539a/g,rs2340690t/c,rs3214832tttgagttatcttatgatcaaaag/-,rs7585486c/g,198180659a/c(无rs编号),rs788016c/t;2、Rs1116734、rs1050347、rs8539、rs2340690、rs788016在不同人种中的分布均有显著性差异(P=0.00)。3、连锁不平衡分析后发现rs1116734与198189061a/g,rs1116734与rs788016不存在连锁不平衡。rs1050347、rs2340690、rs3214832、rs7585486及198180659a/c(无rs编号)两两间完全连锁不平衡,rs8539,198184774ag/--、198180643ac/-两两间完全连锁不平衡。其余位点间均为中度连锁不平衡。4、以r2大小(r2=1)及最小等位基因频率(≥5%)对13个SNPs进行选择,5个代表性SNPs位点rs1116734、rs3749095、rs8539、rs2340690、rs788016可构成9种单倍型。
本部分结果表明中国汉族人群hsp60的SNPs分布有别于其他人种,rs1116734、rs3749095、rs1050347、rs8539、rs2340690、rs3214832、198184774ag/--、rs7585486、198180659a/c、198180643ac/--、rs788016是hsp60基因在中国汉族人群中较常见的SNPs。rs1116734、rs3749095、rs8539、rs2340690、rs788016是五个较有代表性的SNPs。
第二部分hsp60基因多态性在冠心病中的作用
根据位点间D值和SNPs频率,从rs1116734、rs3749095、rs8539、rs2340690、rs788016中优先选择rs788016和rs2340690,应用Taqman基因分型法在674名冠心病病例和744名对照中进行hsp60SNPs基因型与冠心病危险度关系的研究。
结果显示:rs788016和rs2340690各基因型在冠心病组和对照组的分布无显著性差异(P>0.05);按性别、年龄、吸烟状况进行分层后,在年龄小于60岁的男性冠心病患者中,hsp60基因rs788016GG基因型和rs2340690CC+CT基因型的频率低于对照;rs788016AA+AG(相对于GG,OR:1.78,95%CI1.04-3.03)为该人群中冠心病发病的危险因素、rs2340690CC+CT(相对于TT,OR:0.58,95%CI,0.62-5.20)为该人群中冠心病发病的保护因素,但分层分析表明基因型和冠心病发病无关。进一步采用Logistic回归模型排除其他混杂因素分析男性吸烟组中rs788016基因型与冠心病的关系,调整其他因素后,rs788016AA+AG基因型(相对于GG基因型)对CHD有较高的危险性:OR:1.74,95%CI:1.08-2.82。
本部分结果提示在男性吸烟人群中,rs788016AA+AG基因型是冠心病发病的独立危险因素。
本研究的创新之处在于:(1)对中国汉族人群hsp60基因进行了再测序,发现了4个新SNPs;(2)揭示了中国汉族人群hsp60SNPs间的连锁关系,找出了hsp60基因有代表性的SNPs,推算出hsp60基因在中国汉族人群的中主要单倍型;(3)首次进行了hsp60基因SNPs与冠心病关联的研究,发现hsp60基因rs788016可能与冠心病发病生相关,携带rs788016GG基因型个体对冠心病易感性显著降低。
本研究有待深入的地方:(1)hsp60SNPs分子生物学意义;(2)hsp60SNPs在冠心病发病中的分子生物学作用(由其本身或其代表的hsp60基因SNPs引起,还是因2号染色体上其它的连锁基因引起);(3)研究人群中有关Hsp60抗原、抗体等相关分子生物学指标。