红树林泛指生长在热带、亚热带地区河口或海岸潮间带的木本植物群落,是适应陆地与海洋过渡区域的一种特殊森林类型。白骨壤(Avicennia marina)是红树林中常见的红树植物,是群落演替中的先锋物种。对于生长在滨海湿地相对低氧环境的白骨壤而言,其根系统对湿地环境有高度专业化的适应。根据白骨壤根结构生长位置和生长方向不同,将其分为四种根结构,分别为在地面下方水平生长且围绕树干延伸数米的水平根(Cable root)、垂直于水平根向地下生长的锚定根(Anchor root)、垂直于水平根向地上生长并且从泥土浮现在地上的呼吸根(Pneumatophore)及从在呼吸根基部水平方向长出来的直径较细的营养根(Feedingroot)。科研工作者大多从解剖学以及生理学水平上研究白骨壤呼吸根结构,并没有从分子水平上研究其具体发育过程以及负向地性的分子机制。本课题首次通过转录组测序(RNA-seq)方法从分子水平上揭示白骨壤呼吸根发育过程和负向地性形成的分子机制。本文首先通过野外观察白骨壤呼吸根与锚定根在同一水平根上的空间分布情况,通过石蜡切片方法确定不同发育阶段锚定根、呼吸根结构。利用RNA-seq以及生物信息学方法分析不同发育阶段呼吸根、锚定根发育过程的分子机制。其次通过石蜡切片方法比较呼吸根、锚定根、茎尖解剖学上主要区别,利用RNA-seq和生物信息学分析方法分析从微观方面揭示白骨壤生长方向不同呼吸根、锚定根、水平根、茎尖组织向地性生长的分子机制,获得白骨壤根结构的转录组序列,且两两比较分析不同生长方向组织之间转录水平差异,一方面可以揭示白骨壤呼吸根负向地性的分子机制,另一方面可以为筛选植物根系负向地性的分子标记提供理论依据。本研究取得的主要结果和结论如下:1.本研究利用IlluminaHi-seq 2500测序平台进行双端测序,通过对白骨壤不同类型根组织的转录组测序结果进行组装及拼接,获得白骨壤转录组参考序列,包括83131个Unigenes,测序组装质量均符合生物信息学分析标准。对所得的基因在NCBI-NR数据库中注释,有25759个基因被Nr数据库注释,注释率为30.6%。符合转录组测序注释率范围。通过主成分PCA分析揭示白骨壤根组织所有样品重复性均良好,本实验结果有较高的可信度。2.本研究利用石蜡切片技术确定呼吸根发育过程,揭示呼吸根的形成是一个复杂的动态过程,主要包括呼吸根起始阶段以及呼吸根浮现两个阶段。首先呼吸根根原基起源于水平根中柱鞘,经过连续的垂周分裂以及平周分裂,最终根原基从水平根向上生长发育出来,呼吸根是以水平根为主根而发育出来的另一种形态的侧根。通过对白骨壤根组织不同发育阶段进行分析转录组序列信息,特异基因分析结果揭示锚定根发育过程中油菜素内酯和生长素两者共同作用促进其从水平根中发育出来。其发育过程与拟南芥侧根发育过程类似,主要受激素调控,同时揭示锚定根是从水平根生长出来的另一种形式的侧根,是对滨海湿地低氧环境的适应。3.本研究通过解剖水平上研究负向地性呼吸根、负向地性茎尖和向地性锚定根三种生长方向不同组织的差别,显示三种组织结均由表皮、皮层、维管柱三部分组成,在呼吸根和锚定根内皮层中均含有通气组织,但其大小不一样,呼吸根结构中通气组织的面积大于锚定根中通气组织的面积,而茎尖则不存在通气组织;三种组织中木质部发育方式不同,锚定根中木质部的发育方式是外始式,而呼吸根和茎尖中木质部的发育方式为内始式;通过对三种组织做纵切片进行观察,发现呼吸根、锚定根中均有根冠结构,而茎尖则无。白骨壤呼吸根是一类介于真正根结构和茎结构两者之间的特殊根结构,其存在是对滨海湿地这一低氧环境的适应。RNA-seq和生物信息学分析方法分析从微观方面揭示白骨壤生长方向不同呼吸根、锚定根、水平根、茎尖组织向地性生长的分子机制,差异基因分类(Gene Ontology,GO)富集结果表明,白骨壤根系统通过体内进行酶活性调节以适应低氧环境,其负向地性这一生物学过程主要受钙离子信号调节。差异基因和特异基因代谢通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)注释结果相同,均说明白骨壤呼吸根负向地性生长由淀粉通路、钙离子通路以及生长素等通路相互作用共同调控。其中在植物根系统初期发育过程中,通过将发育初期呼吸根与发育初期锚定根两两对比,发现锚定根发育最初阶段其生长方向的确定主要是由淀粉含量(淀粉粒)的不同而决定的。总之,本研究首次完成了白骨壤生长方向不同的根结构转录组测序,从分子水平揭示红树植物白骨壤呼吸根发育阶段及其负向地性的的根本原因,为后续深入研究植物根发育阶段、根系统负向地性的原因提供基因资源,同时为其提供分子基础。