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研究背景:肺癌是近年来发病率和病死率增长最快,对人类健康和生命威胁最大的肿瘤之一。近年人们研究通过刺激机体的免疫系统来抵抗癌症取得了一定的进展,免疫疗法成为治疗肺癌的有效新方法。用肿瘤细胞疫苗去治疗肺癌属于免疫疗法的一种,肿瘤疫苗(tumor cells vaccine)是将具有抗原性的疫苗输入体内,刺激机体免疫系统产生抗肿瘤免疫效应,从而治疗肿瘤。肿瘤疫苗发挥抗肿瘤作用的机理主要是其表达的肿瘤抗原,尤其是特异性的肿瘤抗原,进入体内后能诱导机体产生对肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs),进而杀伤肿瘤细胞。然而,肿瘤细胞能够逃避免疫监视,这不仅仅是因为遗传免疫耐受抑制肿瘤特异性抗原的表达,而且肿瘤细胞还可以通过后天获得的能力改变特异表型,减少人类白细胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)分子的表达和激活肿瘤微环境中免疫抑制剂的分泌从而抑制抗肿瘤免疫应答;同时,不同组织中的肿瘤细胞不仅不同而且遗传学特性不稳定;另外,在肿瘤微环境中,免疫细胞很难完全发挥其细胞毒性作用。这些原因使得肿瘤疫苗的应用有一定的局限性。20世纪70年代初期Harvard大学Folkman教授提出实体肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的生成。在正常人体组织内,血管生成很少发生是因为血管生成抑制因子和血管生成刺激因子处于相对平衡状态。当肿瘤直径小于2-3mm时,肿瘤组织主要靠周围组织的弥散作用来获得氧气和营养物质。但是当肿瘤直径超过2-3mm,“血管生成限制器”因为血供不足而无法工作,在缺氧的条件下,肿瘤细胞和间质细胞像巨噬细胞那样,在血管生成刺激因子分泌物的作用下打开血管生成开关,激活内皮细胞及其前体,生成新的血管。这时,肿瘤呈指数生长,显现出无限制扩张的趋势。血管内皮细胞疫苗以肿瘤血管为靶点,抑制肿瘤血管的形成或破坏已形成的肿瘤血管,从而阻断肿瘤细胞的营养来源和迁移通道,这已经成为抗肿瘤治疗的重要策略。目前,肿瘤细胞疫苗国内外研究的较多,但是血管内皮细胞疫苗(vascularendothelial cells vaccine)仅有少量报道,究竟两种疫苗哪种抗肿瘤效果更为理想还有待进一步研究。实验目的:本实验是通过将小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3s)疫苗和小鼠Lewis肺癌细胞(LLCs)疫苗接种小鼠后,观察疫苗对小鼠Lewis肺癌的抑瘤效应,进一步探讨两种疫苗诱导小鼠抗Lewis肺癌免疫效应的机制。实验方法:1.体外实验:将bEnd.3s和LLCs制备成冻融抗原致敏树突状细胞(dendritic cells,DCs),CCK-8检测冻融抗原致敏的DCs刺激T淋巴细胞增殖能力;MTT法检测冻融抗原致敏的DCs诱导的CTLs对靶细胞特异性的杀伤率。2.体内实验:将bEnd.3s细胞和LLCs细胞制备成疫苗,免疫C57BL/6小鼠后小鼠皮下荷LLCs,接下来的90天观察小鼠皮下移植瘤生长情况、生存期及对免疫小鼠不良反应进行检测;流式细胞术检测免疫小鼠脾T淋巴细胞表面CD3ε、CD8α的表达,CCK-8检测免疫小鼠脾T淋巴细胞特异性的杀伤率;ELISA、Western blot检测免疫小鼠抗血清特异性抗体。3.用SPSS13.0统计软件,小鼠生存率采用Kaplan-Meier法;T淋巴细胞增殖实验、小鼠皮下移植瘤体积、ELISA结果用(?)±s表示;流式细胞术检测结果、CTLs杀伤率用[((?)±s)%]表示;均采用方差分析进行比较,进一步用LSD法做两两比较,检验水准均为α=0.05。实验结果:1.体外实验结果:bEnd.3抗原致敏的DCs组和LLC抗原致敏的DCs组刺激Ts淋巴细胞增殖能力明显高于DCs组和Ts组(P＜0.05);bEnd.3抗原致敏的DCs诱导的CTLs和LLC抗原致敏的DCs诱导的CTLs对各自靶细胞的杀伤率在效靶比30:1时均高于各自的对照组(P＜0.05)。2.体内实验结果:(1)bEnd.3s组和LLCs组小鼠肿瘤体积明显小于PBS组小鼠肿瘤体积,其中bEnd.3s组小鼠肿瘤体积最小,且各组差异有统计学意义(P＜0.05);病理HE染色证实bEnd.3s组小鼠荷瘤部位未发现肿瘤组织,LLCs组和PBS组小鼠荷瘤部位为肿瘤组织;bEnd.3s组小鼠可长期无瘤生存,LLCs组小鼠中位生存期为81天,PBS组小鼠中位生存期为44天;bEnd.3s组小鼠与LLCs组和PBS组小鼠相比,伤口愈合缓慢。(2)流式细胞术检测结果:bEnd.3s组小鼠脾T淋巴细胞表面CD3ε、CD8α表达率为17.8%,LLCs组为14.7%,PBS组为10.7%,且各组差异有统计学意义(P＜0.05)。(3)CCK-8结果:bEnd.3疫苗和LLC疫苗免疫的小鼠均能产生特异性杀伤各自靶细胞的CTLs。bEnd.3s组小鼠产生靶向杀伤bEnd.3s的CTLs,而LLCs组小鼠产生靶向杀伤LLCs的CTLs,与各自对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。(4)ELISA检测结果:bEnd.3s组小鼠抗血清抗体滴度为1:1600,而LLCs组小鼠抗血清抗体滴度为1:800。bEnd.3s组小鼠血清与bEnd.3膜蛋白有抗原抗体反应,与LLC膜蛋白没有抗原抗体反应;LLCs组小鼠血清与LLC膜蛋白有抗原抗体反应,与bEnd.3膜蛋白没有抗原抗体反应。(5)Western blot结果:bEnd.3s组小鼠血清能与bEnd.3膜蛋白反应出现多个阳性带,其中220KD与血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)分子量一致,180KD与Endoglin分子量一致,LLCs组小鼠血清能与LLC膜蛋白反应出现阳性带,200KD与癌胚抗原(CEA)分子量一致。实验结论:1.微血管内皮细胞疫苗和肿瘤细胞疫苗均能诱导小鼠抑制Lewis肺癌皮下移植瘤生长,延长生存期,其机制是两种疫苗均能诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫。2.微血管内皮细胞疫苗抑制小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤效果优于肿瘤细胞疫苗。