论文部分内容阅读
结肠癌(colorectal cancer, CRC)是发生于人体结肠组织的恶性肿瘤，属于全球高发的消化道肿瘤，其早期诊断困难，晚期预后差，严重危害人类健康。正常的结肠上皮细胞由于异常增殖，经由上皮内癌、浸润癌，最终可形成结肠癌。在这个过程中，常常伴随着多种基因突变，包括Ras、c-Myc等癌基因的异常活化及APC、P53等抑癌基因功能的失活，从而使肿瘤细胞表现出其特有的特征：无限增殖，能量代谢异常，转移侵袭等。
有氧酵解是肿瘤包括结肠癌代谢异常的一个显著特点，其机制涉及肿瘤细胞内癌基因活化、抑癌基因失活等异常及肿瘤细胞微环境的改变。研究表明，HIF-1和c-Myc是有氧酵解的关键调控分子，二者通过调控多种代谢关键酶的表达或活性，促进肿瘤细胞的有氧糖酵解，促进肿瘤增殖。多种癌基因或抑癌基因可通过直接或间接调控HIF-1或/和c-Myc而参与结肠癌有氧酵解，但具体机制并未完全阐明，因此也一直是该领域的研究热点。
迁移侵袭抑制蛋白(migration and invasion inhibitory protein，MIIP)是研究者以胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP2)为诱饵分子，对人胎脑cDNA文库进行酵母双杂交筛选相互作用分子时发现的。由于其具有抑制迁移侵袭的功能且编码蛋白的分子量为45KDa，因此又被命名为IIp45。MIIP基因位于人类染色体1p36.22上，该染色体区域在乳腺癌、胰腺癌、胶质瘤等多种类型的肿瘤中普遍缺失。MIIP基因包含10个外显子，转录本全长为1588bp，其编码的蛋白由388个氨基酸组成，是一种高度亲水性蛋白。文献表明，MIIP可通过与多种不同的蛋白相互作用发挥抑癌功能，抑制肿瘤的增殖、迁移、侵袭等恶性行为。目前关于MIIP在结肠癌中的研究报道指出，MIIP可通过抑制NF-?B成员RelA的去乙酰化，抑制转移相关基因的表达；MIIP的杂合缺失可导致染色体不稳定性，进而促进肿瘤进程。基于此，本研究重点从有氧酵解的角度，研究MIIP在结肠癌发生演变过程中的作用及潜在的分子机制。
【目的】
1)比较MIIP蛋白在结肠癌组织与癌旁组织中的表达。
2)研究MIIP表达变化对结肠癌细胞恶性行为的影响。
3)寻找与MIIP相互作用的分子并进行功能验证。
4)筛选MIIP调控的下游分子事件并研究其意义。
【方法和结果】
1)采用免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR、免疫印迹(Western blotting)的方法，分析MIIP在结肠癌临床样本中的表达变化。结果显示，在结肠癌芯片、新鲜临床组织样本中MIIP的mRNA及蛋白水平的表达与对应的癌旁组织相比，均显著降低。
2)以MIIP稳定过表达和对照、MIIP杂合缺失(MIIP+/-)和野生型(MIIP+/+)的结肠癌细胞HCT116为研究对象，在细胞功能学方面，采用CCK-8增殖实验、平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验，分析MIIP对细胞增殖、迁移、侵袭的影响。结果显示，MIIP可抑制结肠癌细胞HCT116的增殖、迁移及侵袭。
3)采用试剂盒检测结肠癌细胞代谢物变化，分析MIIP过表达或敲低对结肠癌细胞葡萄糖摄取，糖酵解产物乳酸生成及丙酮酸生成的影响，明确MIIP在结肠癌有氧酵解中的作用。结果显示，MIIP可抑制葡萄糖摄取、抑制丙酮酸和乳酸生成。采用体外无血清培养体系，分析MIIP过表达或敲低对HCT116干细胞球形成的影响。结果显示，MIIP可降低结肠癌干细胞球形成数目。
4)采用裸鼠荷瘤模型证实MIIP的抑癌作用。结果显示，MIIP+/-HCT116较MIIP+/+HCT116细胞形成移植瘤的速度明显增快、瘤体重量显著增加，表明MIIP可抑制结肠癌在体生长。瘤体组织ki67染色观察细胞增殖情况，结果显示，与对照组相比，MIIP+/-移植瘤ki67阳性细胞比例显著高于MIIP+/+，进一步确认了MIIP的在体抑癌功能。
5)构建带有双重标签的MIIP表达载体，利用串联亲和纯化联合质谱分析技术，寻找与MIIP相互作用的蛋白，研究其与MIIP之间潜在的调控关系。进一步选择糖代谢关键酶丙酮酸激酶PKM2为研究对象，采用co-IP验证二者之间的相互作用，Westernblotting、丙酮酸激酶检测试剂盒分析MIIP过表达及敲低对PKM2蛋白含量、酶活性的影响。结果证实MIIP与PKM2之间存在相互作用，不影响PKM2的蛋白水平但抑制PKM2的酶活性。
6)采用RNA-sequencing和生物信息学分析，筛选MIIP+/-HCT116和MIIP+/+HCT116细胞的差异表达基因，研究MIIP调控的下游分子事件。获得了差异表达基因火山图、MIIP参与调控的相关信号通路及网络。这些结果提示MIIP可参与细胞粘附、血管生成、干细胞增殖等多种生物学过程。进一步在MIIP过表达和敲减细胞中采用实时荧光定量PCR验证了部分差异表达基因。其中我们重点关注了与肿瘤干性相关的基因ALDH1A3，通过Westernblotting进一步证实MIIP可显著抑制ALDH1A3的蛋白表达；且在MIIP+/-HCT116细胞中证实以siRNA敲低ALDH1A3的表达后，干细胞球形成的体积和数目显著减小，表明MIIP可通过抑制ALDH1A3而抑制结肠癌细胞干性。
【结论】
MIIP表达水平在结肠癌组织中明显低于癌旁组织；MIIP可抑制结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭、有氧酵解及干细胞成球能力等恶性生物学行为；采用串联亲和层析鉴定出多个MIIP相互作用蛋白，其中MIIP可通过结合丙酮酸激酶PKM2而抑制其酶活性；此外，MIIP参与调控细胞粘附、血管生成、干细胞增殖等多种生物学过程，其中可通过下调乙醛脱氢酶ALDH1A3而抑制结肠癌干细胞的自我更新。MIIP在结肠癌具有多方面的抑癌作用。
有氧酵解是肿瘤包括结肠癌代谢异常的一个显著特点，其机制涉及肿瘤细胞内癌基因活化、抑癌基因失活等异常及肿瘤细胞微环境的改变。研究表明，HIF-1和c-Myc是有氧酵解的关键调控分子，二者通过调控多种代谢关键酶的表达或活性，促进肿瘤细胞的有氧糖酵解，促进肿瘤增殖。多种癌基因或抑癌基因可通过直接或间接调控HIF-1或/和c-Myc而参与结肠癌有氧酵解，但具体机制并未完全阐明，因此也一直是该领域的研究热点。
迁移侵袭抑制蛋白(migration and invasion inhibitory protein，MIIP)是研究者以胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP2)为诱饵分子，对人胎脑cDNA文库进行酵母双杂交筛选相互作用分子时发现的。由于其具有抑制迁移侵袭的功能且编码蛋白的分子量为45KDa，因此又被命名为IIp45。MIIP基因位于人类染色体1p36.22上，该染色体区域在乳腺癌、胰腺癌、胶质瘤等多种类型的肿瘤中普遍缺失。MIIP基因包含10个外显子，转录本全长为1588bp，其编码的蛋白由388个氨基酸组成，是一种高度亲水性蛋白。文献表明，MIIP可通过与多种不同的蛋白相互作用发挥抑癌功能，抑制肿瘤的增殖、迁移、侵袭等恶性行为。目前关于MIIP在结肠癌中的研究报道指出，MIIP可通过抑制NF-?B成员RelA的去乙酰化，抑制转移相关基因的表达；MIIP的杂合缺失可导致染色体不稳定性，进而促进肿瘤进程。基于此，本研究重点从有氧酵解的角度，研究MIIP在结肠癌发生演变过程中的作用及潜在的分子机制。
【目的】
1)比较MIIP蛋白在结肠癌组织与癌旁组织中的表达。
2)研究MIIP表达变化对结肠癌细胞恶性行为的影响。
3)寻找与MIIP相互作用的分子并进行功能验证。
4)筛选MIIP调控的下游分子事件并研究其意义。
【方法和结果】
1)采用免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR、免疫印迹(Western blotting)的方法，分析MIIP在结肠癌临床样本中的表达变化。结果显示，在结肠癌芯片、新鲜临床组织样本中MIIP的mRNA及蛋白水平的表达与对应的癌旁组织相比，均显著降低。
2)以MIIP稳定过表达和对照、MIIP杂合缺失(MIIP+/-)和野生型(MIIP+/+)的结肠癌细胞HCT116为研究对象，在细胞功能学方面，采用CCK-8增殖实验、平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验，分析MIIP对细胞增殖、迁移、侵袭的影响。结果显示，MIIP可抑制结肠癌细胞HCT116的增殖、迁移及侵袭。
3)采用试剂盒检测结肠癌细胞代谢物变化，分析MIIP过表达或敲低对结肠癌细胞葡萄糖摄取，糖酵解产物乳酸生成及丙酮酸生成的影响，明确MIIP在结肠癌有氧酵解中的作用。结果显示，MIIP可抑制葡萄糖摄取、抑制丙酮酸和乳酸生成。采用体外无血清培养体系，分析MIIP过表达或敲低对HCT116干细胞球形成的影响。结果显示，MIIP可降低结肠癌干细胞球形成数目。
4)采用裸鼠荷瘤模型证实MIIP的抑癌作用。结果显示，MIIP+/-HCT116较MIIP+/+HCT116细胞形成移植瘤的速度明显增快、瘤体重量显著增加，表明MIIP可抑制结肠癌在体生长。瘤体组织ki67染色观察细胞增殖情况，结果显示，与对照组相比，MIIP+/-移植瘤ki67阳性细胞比例显著高于MIIP+/+，进一步确认了MIIP的在体抑癌功能。
5)构建带有双重标签的MIIP表达载体，利用串联亲和纯化联合质谱分析技术，寻找与MIIP相互作用的蛋白，研究其与MIIP之间潜在的调控关系。进一步选择糖代谢关键酶丙酮酸激酶PKM2为研究对象，采用co-IP验证二者之间的相互作用，Westernblotting、丙酮酸激酶检测试剂盒分析MIIP过表达及敲低对PKM2蛋白含量、酶活性的影响。结果证实MIIP与PKM2之间存在相互作用，不影响PKM2的蛋白水平但抑制PKM2的酶活性。
6)采用RNA-sequencing和生物信息学分析，筛选MIIP+/-HCT116和MIIP+/+HCT116细胞的差异表达基因，研究MIIP调控的下游分子事件。获得了差异表达基因火山图、MIIP参与调控的相关信号通路及网络。这些结果提示MIIP可参与细胞粘附、血管生成、干细胞增殖等多种生物学过程。进一步在MIIP过表达和敲减细胞中采用实时荧光定量PCR验证了部分差异表达基因。其中我们重点关注了与肿瘤干性相关的基因ALDH1A3，通过Westernblotting进一步证实MIIP可显著抑制ALDH1A3的蛋白表达；且在MIIP+/-HCT116细胞中证实以siRNA敲低ALDH1A3的表达后，干细胞球形成的体积和数目显著减小，表明MIIP可通过抑制ALDH1A3而抑制结肠癌细胞干性。
【结论】
MIIP表达水平在结肠癌组织中明显低于癌旁组织；MIIP可抑制结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭、有氧酵解及干细胞成球能力等恶性生物学行为；采用串联亲和层析鉴定出多个MIIP相互作用蛋白，其中MIIP可通过结合丙酮酸激酶PKM2而抑制其酶活性；此外，MIIP参与调控细胞粘附、血管生成、干细胞增殖等多种生物学过程，其中可通过下调乙醛脱氢酶ALDH1A3而抑制结肠癌干细胞的自我更新。MIIP在结肠癌具有多方面的抑癌作用。