研究背景:黑素瘤(melanoma)是一种发生于皮肤的恶性肿瘤,其主要表现特征为病程发展迅速、易转移、致死率高。其危险因素包括年龄、性别、种族还有皮肤颜色,甚至还跟患者所在的地理位置相关。近年来,在世界范围内黑素瘤的发病率呈快速增长的趋势,黑素瘤在发生发展过程与多个基因异常表达相关,属于复杂生物过程,在一定几率上和遗传因素存在关系。不过当前阶段,学者们还无法明确其病因和发病机制,这也就增加了治疗黑素瘤的难度,特别是转移性黑素瘤尚缺乏针对性治疗方法,临床疗效不尽如人意。深入阐明黑素瘤发病机制,针对关键环节制定最佳治疗方案是皮肤病学亟待解决关键问题之一。目前,转移性黑素瘤在临床领域的治疗药物主要为高剂量或聚乙二醇化IFN-α和IL-2。此类药物的治疗仅对大约20%的患者产生抗肿瘤作用,但对远期生存率无改变,且容易出现明显的不良反应。多项研究提出黑素瘤患者的MAPK信号通路以及PI3K/AKT信号通路之所以活化,主要原因就是BRAF、NRAS、NF1以及PTEN基因出现了突变,影响黑色素细胞程序性死亡,从而导致了黑素瘤的发生。识别这些调控黑素瘤发生和发展的基因对早期干预和治疗晚期恶性黑素瘤至关重要,因此针对这些基因突变的分子靶向药物成为黑素瘤靶向治疗的重要研究热点,近几年采用的靶向治疗包括:BRAF抑制剂(威罗菲尼)、MAPK/ERK信号通路抑制剂(曲美替尼)、c-Kit以及PI3K/AKT/mTOR抑制剂等,但是这些药物在治疗黑素瘤的时候常常因为引起消化系统的毒性或者诱发自身免疫性疾病而使部分患者终止治疗。近年来,黑素瘤的免疫治疗逐渐引起研究者关注,目前在免疫治疗方面治疗黑素瘤多使用PD-1单抗,虽然PD-1单抗有效提高了患者的肿瘤生存率,但PD-1单抗也存在一些不足,如有效率较低,临床治疗中PD-1抗体仅对20%左右的患者有效,而且价格昂贵。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)可结合靶基因的3’-UTR抑制转录后翻译以及蛋白编码基因翻译。在基因组中miRNA所占的比重大约为1%,miRNA调控的基因占到了人类基因组的1/3。研究指出,miRNA变异由遗传突变或染色体畸变引发,进而影响到细胞再生、分化等。研究表明,miRNA涉及到多种肿瘤的发展过程。在众多miRNA中研究人员较早发现miR-21参与到细胞的生长、凋亡等环节,发现miR-21可以异常表达于肺癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤中。一些研究人员提出,miR-21对Bcl-2等抑癌基因有调控作用,发挥生物学功能。同时,miR-21可通过调节转化生长因子-β,原肌球蛋白1等表达,进而影响肿瘤生物学发生、发展。斑蝥素(Cantharidin,CTD)属于一种PP2A抑制剂。PP2A可实现对细胞增殖以及蛋白转录的有效调控。斑蝥素及其衍生物已被证实有抗肿瘤活性,包括了慢性骨髓白血病、肝癌等。目前临床上已被应用抗肿瘤的CTD及其衍生物包括复方斑蝥素胶囊,斑蝥酸钠注射液,去甲斑蝥素等。一些研究学者提出CTD对结直肠癌等表现出细胞毒性作用,可以通过调节机体免疫系统,提高免疫应答能力发挥抗肿瘤作用。CTD治疗恶性肿瘤主要通过作用于肿瘤细胞周期进展打断细胞增殖,或者诱导细胞凋亡,还可以抑制肿瘤新生血管的生长等机制发挥作用。研究发现,去甲斑蝥素可以引起K562细胞中miR-16、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-17以及miR-125的表达水平升高,同时还可以导致miR-106、miR-150等表达下降。一些文献报道提出,CTD会阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡,对A375-S2侵袭以及凋亡等有抑制作用。关于CTD是否会引起黑素瘤细胞中miR-21的表达变化还没有报道。我们通过研究CTD调控miR-21/PTEN通路抑制黑素瘤细胞增殖的情况,探讨其潜在的抗肿瘤机制。研究目的:1.本文对miR-21及PTEN蛋白在黑素瘤和正常皮肤组织中的表达进行研究;在miR-21表达下调后观察A375细胞中PTEN所出现的变化,探讨miR-21/PTEN在A375细胞增殖,侵袭和转移中的作用以及潜在的机制。2.研究CTD是否通过靶向调控miR-21/PTEN通路抑制A375细胞的增殖,并探讨其潜在的抗肿瘤机制。第一部分miR-21通过靶向调控PTEN影响A375细胞增殖研究方法:1.应用RT-PCR分别检测20例黑素瘤组织和正常皮肤组织中miR-21和PTEN的mRNA表达水平。蛋白免疫印迹(Western blot,WB)测定20个黑素瘤组织和正常皮肤标本中PTEN的蛋白表达水平。2.实验中我们用miR-21 inhibitor先转染A375细胞,然后通过细胞计数试剂盒和细胞划痕实验来分别检测miR-21 inhibitor转染后A375细胞增殖和迁移能力的变化情况。3.miR-21 inhibitor 转染 A375 细胞后,Western blot 检测 A375 细胞 PTEN 蛋白、AKT和mTOR等蛋白的表达变化情况。还做了双荧光素酶报告基因实验,通过这个实验来明确A375细胞中PTEN与miR-21的靶向关系。研究结果:1.RT-PCR检测结果显示皮肤黑素瘤中miR-21的表达增加,PTEN的表达降低;Western blot结果皮肤黑素瘤中PTEN在蛋白水平表达比起正常皮肤明显降低。2.下调miR-21表达能够抑制A375细胞的迁移和增殖,且能提高PTEN的表达:对体外培养的A375细胞进行miR-21抑制剂处理48小时后,通过细胞划痕实验和CCK-8测定法发现下调miR-21可降低细胞迁移和增殖。RT-PCR结果证实在体外培养的A375细胞中,miR-21抑制剂显著增加PTEN表达,Western blot检测结果显示PTEN蛋白水平表达升高。3.双荧光素酶报告基因实验进行检测,实验结果显示miR-21可以与PTEN3’UTR结合并调控其表达,该实验说明PTEN是miR-21的下游靶基因。4.下调miR-21表达可以降低A375细胞中p-AKT和p-mTOR的表达:给予miR-21抑制剂处理A375细胞,通过Western blot检测,结果显示下调miR-21表达可以降低A375细胞中p-AKT和p-mTOR的表达,但总AKT和总mTOR的表达无明显变化。结论:在恶性黑素瘤中,miR-21表达水平提高,PTEN表达水平降低;miR-21对A375细胞增殖以及迁移表现出显著的促进作用,该作用主要通过靶向抑制PTEN的表达,改变AKT和mTOR信号通路活性实现。第二部分斑蝥素通过调控miR-21/PTEN通路抑制A375细胞增殖研究方法:1.培养A375细胞,对细胞实施CTD药物处理,利用CCK-8检测方法检测CTD处理24h、48h、72h、96h后人黑素瘤细胞A375增殖情况。2.对培养的A375细胞实施CTD药物处理,菌落形成实验检测细胞的数量。3.建立皮下异种移植肿瘤模型,检测CTD处理后肿瘤的生长。4.使用CTD对A375细胞进行处理,并对细胞凋亡进行检测;实验采用WB检测细胞中Bc12、Bax以及活性caspase3等表达情况。5.RT-PCR检测CTD处理A375细胞后miR-21和PTEN表达;WB检测PTEN和pAKT的表达。6.培养 A375 细胞,并转染 miR-21 agomir,miR-21 antagomir 和 PTEN siRNA,然后对细胞实施CTD处理,CCK-8法观察A375细胞的增殖情况。研究结果:1.CTD抑制A375细胞的增殖和异种移植小鼠模型的成瘤性:用三种不同浓度的CTD处理A375细胞,然后再通过CCK-8试验,观察细胞在48h,72h和96h的增殖情况,结果显示CTD能够明显抑制A375细胞的增殖活性,该作用随着CTD浓度的增加抑制作用明显增强,可以认为CTD对A375细胞抑制效果存在一定的浓度依赖性,本实验选取的三个浓度中5μM抑制作用显示最强。菌落形成实验结果显示CTD处理可以减少A375细胞群的数量。建立裸鼠皮下异种移植肿瘤模型,实施CTD处理后观察小鼠肿瘤体积的变化情况,结果显示CTD处理组的异种移植肿瘤的瘤体增大和生长速度明显比对照组缓慢,差异有显著性。说明CTD在抑制肿瘤模型体内黑素瘤的生长方面有一定的效果。2.我们用CTD处理A375细胞,Annexin V-FITC/PI染色后流式细胞仪观察细胞的凋亡数量,发现CTD处理后细胞凋亡数目明显增多;Western blot检测CTD处理后细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,相应的促细胞凋亡的蛋白Bax和活性Caspase3的表达显著增加。通过这两个实验的结果说明CTD能诱导促进A375细胞的凋亡。3.在A375细胞中CTD抑制miR-21并促进PTEN表达:CTD处理体外培养的A375细胞后,通过RT-PCR和Western blot检测发现CTD治疗组中miR-21的表达降低,PTEN的表达增加,并抑制AKT磷酸化修饰。4.CTD通过靶向调控miR-21/PTEN抑制A375细胞增殖:为了进一步验证下调miR-21和CTD诱导的抑制A375细胞增殖效果之间的关系,本研究分别使用 miR-21 agomir、miR-21antagomir 和 siRNA PTEN 对 A375 细胞进行处理,观察不同处理后CTD对A375的增殖和肿瘤发生的影响。CCK-8法检测发现miR-21 agomir 和 miR-21antagomir 分别抑制或增强 CTD 对 A375 细胞增殖的抑制作用,而联合PTEN过表达或抑制分别逆转上述结果。说明CTD通过靶向调控miR-21/PTEN抑制A375细胞增殖。结论:CTD对A375细胞增殖具有抑制作用,该抑制作用是通过减少miR-21增加PTEN,降低AKT信号通路活性实现。CTD对异种移植小鼠的黑素瘤模型具有抑制肿瘤增长的作用。