SanglifehrinA(SFA)是由淡黄色链霉菌Streptomyces flaveolus A92-308110产生的一种新型免疫抑制剂。其独特的化学结构包含了一个22元大环内酯和一个罕见的6，6螺环单元。在生物学上SFA表现出强烈的免疫抑制活性，作用机制不同于现有任何的免疫抑制剂。通过对SFA生物合成机制研究，利用代谢工程和生物化学方法获取更多的衍生物、阐明独特酶催化反应的机制，将为新药的开发以及发展新型酶促反应在有机合成方面的应用起到推动作用。　　 利用PEG介导的原生质体转化以及E. coli S17-1和S. flaveolus之间的接合转移建立了有效的遗传转移系统；采用SuperCosI为载体构建了高质量基因组文库，效价达25，000 cfu/μg DNA。　　 影响SFA发酵产量的一些因素得到了优化，使SFA的产量相对于文献报道提高了20多倍(文献为100μg/L，我们的产量为2mg/L)，基本满足代谢工程研究的要求。　　 根据非核糖体聚肽合成酶(NRPS)和聚酮合成酶(PKS)保守区域设计了简并引物；以S.flaveolus基因组DNA为模板，通过PCR扩增克隆得到11个NRPS和7个PKS基因片段。利用这些片段作为探针进行基因文库筛选，克隆到了6处约50～210 kb的连续DNA区域，通过PCR实验、端基DNA顺序分析以及基因中断结果排除了与SFA生物合成相关。　　 利用上述NRPS和PKS引物，对文库中随机挑选的1000个黏粒进行PCR筛选，最终得到2组可能同时含有NRPS和PKS基因的黏粒。基因中断实验否定了这些基因与SFA生物合成相关。　　 根据巴豆酰辅酶A还原酶(CCR)保守区域设计了2组简并引物；对S.flaveolus基因组DNA PCR克隆得到了3组CCR基因。通过文库筛选和PKS引物PCR实验证实一组黏粒和PKS基因连锁，通过3轮的染色体步移克隆到了150 kb连续的DNA区域，基因置换证实与SFA生物合成相关。　　 通过测序共获得118,372 bp连续DNA序列，共包含44个开放阅读框架(ORF)；推测有17个ORF与SFA生物合成相关，其中包含了1个NRPS基因，7个PKS基因，2个脂肪酸合成酶(FAS)基因。确定了PKS基因中的酮基合成酶(KS)、酰基转移酶(AT)、酮基还原酶(KR)、脱氢酶(DH)、烯醇还原酶(ER)及酰基载体蛋白(ACP)结构域；分析了AT，KR的底物选择性和立体选择性。确定了NRPS基因中的缩合蛋白(C)、腺苷化(A)及肽酰基载体蛋白功能域(PCP)；分析确定了NRPS中的3个A功能域的底物选择性依次为缬氨酸，间羟基苯丙氨酸和哒嗪酸。对哒嗪酸结构、起始缩合单元和特殊的聚酮链延伸单元的生物合成机制进行了推测。基于SFA基因簇中各基因或结构域功能分析以及相互关系提出了SFA生物合成的分子模型。　　 构建了6组基因置换质粒(对应于失活orf1，2，18，19～21，23，25)用于SFA生物合成基因簇边界确定，目前接合转移正在进行中。构建了10组基因置换质粒(对应于失活orfA6，A7，C1，C2，C3，C4，C5，E1，F1，G1)，其中7组相应的突变株已经完成了发酵和检测。　　 利用异源宿主E. coli BL21(DE3)表达纯化了NRPS的各个包含A的功能域和模块(A，A-PCR,C-A-PCP)；纯化了可能参与起始缩合单元合成的E1(推测为天冬酰胺合成酶)，以及可能参与哒嗪酸生物合成的C2(推测为鸟氨酸N-5氧化酶)，C3(推测为锌离子结合蛋白)，C4(推测为短链脂酰脱氢酶)。目前体外功能验证在进行中。　　 综上所述，本文设计了一条新的克隆策略，成功地克隆了SFA生物合成基因簇。根据序列分析和体内、体外的功能研究结果，我们推测了SFA崭新的PKS/NRPS单元的生物合成机制，同时发现了一些新颖的酶。本研究工作不仅对聚酮聚肽杂合的复杂天然产物作出了一个新的研究，也为代谢工程获取大量SFA衍生物奠定了基础。