研究背景随着经济飞速发展及生活水平的提高,环境污染日益加重,糖尿病(diabetes mellitus, DM)发病率逐年升高。根据中国2010年的流行病学调查数据,中国18岁及以上成年人糖尿病患病率为11.6%,其中男性患病率为12.1%,女性为11.0%；城市居民患病率为14.3%,农村居民患病率为10.3%同时。糖尿病是一组以长期高血糖为主要特征的常见的内分泌代谢病,是一种由遗传和环境因素相互作用而引起的常见病,主要由于胰岛素分泌的绝对或相对不足以,以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低所致,临床以高血糖为主要标志,常见症状有多饮、多尿、多食以及消瘦等,可引起脂肪、蛋白质、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征,并可并发眼、肾、神经、心血管等多脏器的慢性损害。其中,1型糖尿病(Type1diabetes mellitus, T1DM)可分为1A型和1B型,1A型糖尿病主要是由于自身免疫性8细胞破坏,导致胰岛素绝对缺乏；而1B型糖尿病患者胰岛素缺乏的机制不明,且有发生酮症酸中毒的倾向。1型糖尿病作为一种T细胞介导的自身免疫性疾病,主要由于免疫系统功能的紊乱,胰岛β细胞进行性的破坏,从而引起胰岛素绝对缺乏,本病可发生于任何年龄,多见于儿童及青少年,其发病率逐年增加,预计到2020年,5岁以下儿童的患病率将增1倍左右。1型糖尿病的发病与β细胞自身抗原、巨噬细胞、树突状细胞、B淋巴细胞及T淋巴细胞等有关,细胞因子、趋化因子及介质也参与其发病。大量研究表明1型糖尿病患者常非单一起病,多合并自身免疫性甲状腺疾病(AITD)等其他免疫疾病起病,根据研究显示15-30%的T1DM患者同时患有自身免疫异性甲状腺疾病,4-9%的T1DM患者有乳糜泻,0.5%同时患Addison’s。CD4+T淋巴细胞(T help cell,Th)是构成人体免疫系统的主要细胞,可能在1型糖尿病及2型糖尿病发生发展过程中发挥重要作用,既往人们把CD4+T淋巴细胞分为Thl/Th2两个亚群,Thl细胞群主要分泌IFN-γ, TFN-α及IL-2等细胞因子,介导细胞免疫反应；Th2细胞群主要表达IL-4、IL-10及1L-13等细胞因子,主要增强B细胞介导的体液免疫应答。近年有研究报告从Lyme disease患者炎症关节中分离出的CD4+细胞包含一种产生白细胞介素17(IL-17)的Th细胞亚群,该亚群与已经发现的Th1和Th2细胞亚群无论在分化途径、信号转导,还是生物学功能等方面均有差异,被命名为Th17,其可分泌IL-17, IL-21, IL-22等,作用于不同的靶细胞,诱导其他细胞因子的产生,触发炎症递质的释放,从而在促炎反应、介导慢性炎症、防御胞外细菌感染、自身免疫性疾病、肿瘤以及移植排斥反应等的发生发展中发挥重要作用,其中Th17亚群与自身免疫病关系尤为密切,已有研究证实其参与系统性红斑狼疮、炎症性肠病、实验性自身免疫性脑脊髓炎等多种自身免疫性疾病的发生发展。1型糖尿病作为一种常见的自身免疫性疾病,其发生发展与CD4+T淋巴细胞亚群的失衡关系密切,主要由外周免疫调节失衡所致,即由调节T淋巴细胞(Treg)和效应T淋巴细胞(Teff)来源的相关细胞因子所介导的胰岛β细胞破坏所致。近年来免疫学防治成为1型及2型糖尿病的研究热点。研究目的利用酶联免疫吸附实验及流式细胞技术检测1型糖尿病(T1DM)组、2型糖尿病(T2DM)对照组及健康对照组患者外周血Th1, Th2, Th17, Treg细胞来源细胞因子的表达水平,并分析1型糖尿病(T1DM)合并自身免疫性甲状腺疾病(AITD)患者胰岛相关抗体及甲状腺相关抗体阳性率及其外周血相关细胞因子表达水平,分析T1DM合并AITD临床特点,探讨各细胞因子在糖尿病,尤其是1型糖尿病发生发展中的作用。研究方法共180例病人纳入研究,分成3组,其中1型糖尿病组63例,2型糖尿病对照组60例,健康对照组57例,采集空腹静脉血,利用双抗体夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA)检测JIFN-γ,IL-4,IL-17,IL-10表达水平,按照ELISA试剂盒提供的方法,设置准品孔和样本孔,标准孔各加不同浓度标准品50ul,样本孔加待测样本l0ul及稀释液40ul,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μ L,用封板膜封住反应孔,恒温箱温育60min,然后弃去液体,每孔加满洗涤液,静置1min,去除洗涤液,如此重复洗板5次,每孔加入底物50μ L,37℃避光孵育15min。最后,每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔OD值,绘制标准曲线,计算样本浓度。采用化学发光法检测甲状腺功能及甲状腺相关抗体,采用免疫印迹法检测胰岛相关抗体等。后期采用流式细胞技术进一步进行检测,收集病人静脉血,于24小时内采用流式细胞技术检测糖尿病患者外周血相关细胞因子表达水平。研究结果1、双抗体夹心法酶联免疫吸附实验检测糖尿病患者外周血IFN-γ、IL-4、 IL-10、IL-17结果显示：1型糖尿病组IFN-γ表达水平高于健康对照组,差异具有统计学意义[(400.95±51.44)比(340.99±39.47)pg/ml,t=6.49,P<0.01];IL-17表达水平高于健康对照组,差异具有统计学意义[(26.87±2.47)比(19.41±2.80)pg/ml,t=14.29,P<0.01];1型糖尿病组IL-4表达水平低于健康对照组,差异具有统计学意义[(21.63±4.22)比(31.49±2.42)pg/ml,t=-14.76,p<0.01]； IL-10表达水平低于健康对照组,差异具有统计学意义[(15.69±3.22)比(24.13±2.17)pg/ml,t=-15.75,p<0.01]。2型糖尿病对照组IFN-丫低于健康对照组,差异具有统计学意义[(303.67±50.33)比(340.99±39.47)pg/ml,t=-3.77,P<0.01]; IL-10表达水平低于健康对照组,差异具有统计学意义[(22.49±2.95)比(24.13±2.17)pg/m1,t=-2.9,P<0.01]；2型糖尿病组IL-17表达水平高于健康对照组,差异具有统计学意义[(21.50±2.15)比(19.41±2.80) pg/ml, t=3.71, P<0.01]; IL-4表达水平高于正常健康对照组,差异无统计学意义[(32.69±4.10)比(31.49±2.42) pg/ml, t=1.55, P>0.05]。1型糖尿病组IFN-γ和IL-17均高于2型糖尿病对照组,差异同统计学意义(t=8.93、10.69,P<0.01)；1型糖尿病组IL-4和IL-10均低于2型糖尿病对照组,差异有统计学意义(t=-12.38,-10.22,P<0.01)。其中T1DM组病程≤2年者,INF-γ水平低于病程>2年者,IL-17、IL-4、IL-10表达水平高于病程>2年者,但差异均无统计学意义(p>0.05)。T2DM组病程≤2年者,IFN-γ及IL-17水平高于病程>2年者,IL-4、IL-10水平稍低于病程<2年者,但差异均无统计学意义(P>0.05)。同时在糖尿病病人,血清IL-17表达水平与IFN-γ存在正相关关系(r=0.715,P<0.05),与IL-10负相关(r=-0.61,P<0.05)。T1DM任一胰岛相关抗体阳性者,即组谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab),胰岛素自身抗体(IAA),胰岛细胞抗体(ICA)任一阳性者,抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)、甲状腺球蛋白抗体(TG-Ab)、抗TSH受体抗体(TR-Ab)阳性率均高于胰岛相关抗体阴性组,差异有统计学意义(P<0.05),但各细胞因子表达水平无明显差异。T1DM患者血清IL-17水平与HbAlc水平正相关(r=0.59,P<0.05)。2、流式细胞仪检测糖尿病患者外周血IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17结果显不：三组间Th17/CD4+T细胞(%)有显著差异,1型糖尿病组Th17/CD4+T细胞(%)[2.30(1.65/4.30)]高于2型糖尿病对照组[2.00(1.08/2.88)],高于健康对照组[1.15(0.63/1.70)], Kruskal-Wallis H检验结果示H=8.54,P<0.05;三组间Thl/CD4+T细胞(%)有显著差异,1型糖尿病组Thl/CD4+T细胞(%)[15.55(13.25／17.47)]高于2型糖尿病对照组[14.55(11.78/15.38)],高于健康对照组[10.75(8.50/13.45)], Kruskal-Wallis H检验结果示H=9.31,P<0.05;三组间Th2/CD4+T细胞(%)无显著差异,1型糖尿病组Th2/CD4+T细胞(%)[3.35(2.37/5.65)]低于健康对照组[5.30(3.85/7.40)],低于2型糖尿病对照组[5.40(2.92/7.70)],Kruskal-Wallis H检验结果示H=4.33,P>0.05.研究结论1型糖尿病及2型糖尿病患者,外周血CD4+T细胞各亚群间平衡失调,Th1/Th2及Th17/Treg平衡失调,向Thl及Th17方向偏移,1型糖尿病患者以细胞免疫、IL-17介导的前炎症反应为主,而且伴有体液免疫缺陷；而2型糖尿病患者可能存在细胞免疫缺陷,同时伴有自身免疫性炎症,不同病程的糖尿病患者表现出不同不同细胞因子占优势的趋势。同时在糖尿病病人,血清IL-17表达水平与IFN-γ存在正相关,与IL-10负相关。T1DM患者血清IL-17水平与HbAlc水平正相关。T1DM胰岛相关抗体阳性患者,具有更高的甲状腺相关抗体阳性率,可能具有更高的自身免疫性甲状腺疾病风险。