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目的:从性状、显微鉴定入手,结合图像处理技术,探索砂仁客观量化分析的方法,解决传统经验鉴定主观性强、标准模糊等问题。同时,补充砂仁非挥发性成分的研究,包括测定不同产地砂仁的总酚含量及其抗氧化活性,建立不同产地砂仁的HPLC指纹图谱,应用UPLC-ESI-QTOF-MS定性分析砂仁的非挥发性成分,评价不同产地砂仁成分上的差异。此外,通过砂仁的水提物促胃肠动力作用和砂仁挥发油对番泻叶致泻小鼠的止泻作用,比较不同品质的砂仁的药效作用差异。通过从性状量化、成分分析和药效比较等方面建立多元化的砂仁质控模式,探索快速、高效、准确的砂仁品质评价方法,对市场流通的砂仁进行品质评价;同时,探索云南引种阳春砂在性状、成分和疗效上与道地阳春砂的接近程度,为我国砂仁的种植与综合开发提供理论依据。方法:1.基于砂仁性状和显微鉴定的量化研究结合图像处理技术,通过聚乙二醇熔融包埋砂仁的果皮,切片后制作显微装片,放大后摄取图片,使用Image pro plus(IPP)软件测量不同产地砂仁的果皮厚度;此外,采用四分法随机抽取砂仁样品,使用单反相机摄取砂仁图片,通过Matlab 2014a软件,结合软件提供的操作函数和图像的特征来组合并编写操作程序,再通过使用相同的程序算法来进行图像处理,提取砂仁的形状、颜色和纹理特征参数,最后应用统计学方法分析不同产地的砂仁之间的差异。2.基于砂仁非挥发性成分的质量评价研究以总酚含量为评价指标,运用L9(34)正交试验考察提取时间、提取次数和料液比对砂仁总酚提取率的影响,优化总酚的提取工艺;以香草酸为对照品,采用福林酚比色法测定砂仁中总酚含量;通过DPPH法,ABTS法和FRAP法测定不同产地砂仁的抗氧化活性;以及运用统计学分析获取砂仁总酚含量与抗氧化活性之间的相关性。建立不同产地砂仁的HPLC指纹图谱,通过相似度评价、聚类分析和PCA等统计方法对不同产地的砂仁药材的质量进行评价;建立砂仁非挥发性成分UPLC-ESI-QTOF-MS方法,结合二级碎片离子信息和文献报道,推测可能含有的成分并通过与标准品比对,鉴定砂仁中所含的非挥发性成分。3.不同品质砂仁的药效学研究3.1砂仁水提物促进胃肠动力作用的实验研究选取3批不同产地的砂仁样品:云南引种阳春砂,道地阳春砂和来自缅甸的进口砂仁。选用昆明种小鼠64只,随机分为8组,其中每个产地砂仁各设定高、低两个剂量组,阳性药(枸橼酸莫沙必利)和空白对照各一组。采用改良后的酚红糊剂法,通过测定各实验组动物的食物胃排空、胃肠标记物酚红的胃内残留及小肠推进情况,比较不同产地砂仁水提物对小鼠胃排空和肠推进的作用。3.2砂仁挥发油对番泻叶致泻小鼠的止泻作用研究选用雄性昆明种小鼠72只,随机分为9组:每个产地砂仁各设定高、低两个剂量组,阳性药(盐酸小檗碱)组,模型组和空白组。对番泻叶致泻小鼠模型进行湿粪计数,计算腹泻指数,并应用统计学方法进行分析。成果:1.基于砂仁性状和显微鉴定的量化研究(1)测得22批不同产地的砂仁果皮厚度,总体而言,其厚度从小到大排列为:云南阳春砂<阳春道地砂仁<伪品砂仁<绿壳砂<进口砂仁;通过对果皮厚度进行聚类分析,可把22批砂仁分为两大类,其中5批进口砂仁和2批艳山姜归为一类,其余17批砂仁归为另一类。可见此方法可以把进口砂仁和艳山姜伪品从其余砂仁样品中区分出来,可为砂仁药材的品质评价提供参考。(2)提取计算得22个不同产地砂仁的形状(长宽比、矩形度、圆形度)、颜色(色调、饱和度)和纹理(灰度纹理、色调纹理、饱和度纹理)特征参数;结合聚类分析方法,通过形状特征可以把艳山姜、长条形的进口砂仁和椭圆或卵圆形的砂仁区分开来;颜色特征可以明确鉴别艳山姜伪品和部分伪品砂仁与其余样品间的差异;纹理特征能明确把进口砂仁、伪品砂仁、艳山姜从阳春砂、绿壳砂中区分出来,为鉴别药典品砂仁和非药典品砂仁提供帮助。而对砂仁的三个性状特征(形状、颜色和纹理)进行主成分分析以评价砂仁样品时,对鉴别药典收载的阳春砂、绿壳砂和非药典收载的混伪品种(进口砂仁、伪品砂仁、艳山姜)具有较好的效果,其结果与使用纹理特征参数聚类分析的结果一致。2.基于砂仁非挥发性成分的质量评价研究(1)砂仁总酚含量测定的线性范围为0.00200.0119 mg.mL-1,平均加样回收率为96.6%(RSD=3.3%,n=6);3种抗氧化方法测定的砂仁抗氧化活性均与总酚含量呈显著正相关(P<0.01),相关系数分别为0.964,0.965和0.958。(2)建立了砂仁的HPLC指纹图谱共有模式,共有峰合计29个,22批不同产地砂仁的相似度在0.5480.944之间;结合聚类分析方法可鉴别艳山姜、进口砂仁和阳春产地的砂仁、绿壳砂之间的差异,但来自云南不同产地的阳春砂的差异较大,不能完全与艳山姜、进口砂仁区分开来。(3)建立了砂仁非挥发性成分的UPLC-ESI-QTOF-MS分析方法,鉴定了砂仁中12个非挥发性成分;通过PCA分析,可以明确鉴别艳山姜伪品的差异,在一定程度上对不同品种的砂仁有鉴别作用。3.不同品质砂仁的药效学研究3.1砂仁水提物促进胃肠动力作用的实验研究枸橼酸莫沙必利、云南和阳春砂仁水提物对正常小鼠的胃排空具有促进作用,云南和阳春砂仁的高剂量水提物促进胃排空作用比枸橼酸莫沙必利强;枸橼酸莫沙必利、云南砂仁水提物和阳春砂仁水提物均对小肠推进具有促进作用,作用效果相当,相互之间没有统计学差异;而缅甸砂仁水提物对胃排空作用不明显,与空白小鼠之间没有差异,对酚红的推进至小肠Ⅱ段,与空白组相比具有显著性差异。3.2砂仁挥发油对番泻叶致泻小鼠的止泻作用研究盐酸小檗碱、阳春砂仁挥发油高剂量以及云南砂仁挥发油高剂量均能有效降低腹泻小鼠的腹泻指数,且具有统计学意义;而缅甸砂仁挥发油虽然亦能降低腹泻指数,但其与模型组相比没有显著差异。此外,云南砂仁挥发油与阳春砂仁挥发油的止泻作用没有统计学差异。表明云南和阳春砂仁挥发油均对番泻叶致泻小鼠有止泻作用。结论:以砂仁的性状和显微鉴别为基础,结合图像处理技术,实现了砂仁外观性状数据化测量,果皮厚度可把进口砂仁和艳山姜伪品从其余砂仁样品中区分出来;形状、颜色或纹理特征参数均能单独鉴别艳山姜、进口砂仁与其余样品的差异;纹理特征参数或把三种特征参数相结合的方法对鉴别药典收载的阳春砂、绿壳砂与非药典收载的混伪品种(进口砂仁、伪品砂仁、艳山姜)具有更好的效果。建立的HPLC指纹图谱和UPLC-ESI-QTOF-MS分析方法可以明确鉴别艳山姜伪品的差异,在一定程度上对不同品种的砂仁有鉴别作用。不同产地砂仁的总酚含量差异显著,并具有一定的抗氧化活性,有待进一步控制和开发应用。云南引种砂仁与阳春砂仁促进胃肠动力及止泻效果较好且没有明显差异,对胃肠道均具有较好的双向调节作用;缅甸砂仁的药效相对较差。所建立的方法能有效地对砂仁进行区分,可以反映砂仁的品质。东南亚等地区的进口砂仁与道地阳春砂差异较大,再加上品种混乱,质量合格率低等因素,建议加强市场监管力度,对进口砂仁的来源进行严格的管控。云南引种砂仁在性状、成分及疗效上非常接近道地阳春砂,因此应积极推广云南引种砂仁种植业的发展,以满足更多的需求。