第一部分DLBCL中PI3K/AKT亚单位的拷贝数变异及其临床病理意义目的：研究弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)中PI3K/AKT活化的机制以及其临床病理相关性,从PI3K/AKT亚单位拷贝数变异(copy number variation, CNV)的角度阐述DLBCL的发病机理,以期为DLBCL的诊断以及预后评估提供新的分子指标。方法：收集复旦大学附属肿瘤医院病理科2005年-2011年间新鲜DLBCL组织标本60例,其中57例收集到随访资料；同时收集淋巴组织反应性增生(reactive hyperplasia, RH) 10例作为对照。利用高通量NanoString nCounter技术同时检测PI3K/AKT通路中12个基因的拷贝数变异(CNV),包括PI3K主要的催化亚单位和调节亚单位以及其下游AKT的亚单位,分析其与DLBCL临床病理参数和预后的关系。结果：(1)利用NanoString nCounter技术检测PI3K主要的催化亚单位和调节亚单位以及其下游AKT的亚单位,包括PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD, PIK3CG, PIK3C2A, PIK3C2B, PIK3C2G, PIK3R1, PIK3R2, AKT1, AKT2, AKT3。除了PIK3R1,所有PI3K和AKT的亚单位均检测到拷贝数的扩增和缺失,变异率从8.3%-20.0%不等。其中大部分基因为拷贝数扩增,扩增比例占发生拷贝数变异的64%-100%,只有PIK3CD以拷贝数缺失为主,占拷贝数变异的70%。PI3K/AKT通路中发生拷贝数变异的频率达到58.3%。(2)同时在DLBCL和BL细胞系中检测发现DOHH2,LYl,LY8和Toledo均存在拷贝数扩增。(3)PIK3CA, PIK3CB,PIK3CD和PIK3CG的CNV与临床病理指标,年龄、性别、临床分期、IPI、大块病变、B症状和乳酸脱氢酶水平无明显的相关性(P>0.05)。其中PIK3CA和PIK3CB基因的CNVs与总生存期短密切相关(分别是P=0.029和P=0.019)。结论：PI3K/AKT通路各亚单位CNV在DLBCL的发生中可能起重要作用,并可能是AKT信号通路活化的原因。PIK3CA和PIK3CB的拷贝数扩增对于预测DLBCL的预后具有重要意义。第二部分DLBCL中p110催化亚单位和pAKT的表达及其临床病理意义目的：PI3K/AKT信号通路在DLBCL中发挥重要作用,已经证实该信号通路的基因存在拷贝数变异,但是与蛋白表达之间的关系还不清楚。通过研究DLBCL中PI3K亚单位的表达初步探讨PI3K/AKT通路活化的机制,以期为DLBCL的诊断以及预后评估提供新的分子指标。方法：收集复旦大学附属肿瘤医院病理科2005年-2011年间新鲜DLBCL组织对应石蜡标本60例,其中57例收集到随访资料；同时收集淋巴组织反应性增生(reactive hyperplasia, RH) 10例作为对照。用免疫组织化学方法(immunohistochemistry, IHC)检测p110α, p110β, p110γ, p110δ和pAKT的表达。结果：(1)在DLBCL组织芯片中检测p110α,p110β,p1101,,p110δ和pAKT表达发现,在RH中生发中心内外均可见散在分布的阳性表达的淋巴细胞,在DLBCL中呈不同程度的弥漫阳性表达。阳性表达率分别是80%、81.6%、81.6%、81.6%和75%,强阳性表达率是26.7%、25.0%、18.3%、25.0%和16.7%。(2)除了p110δ的强阳性表达与DLBCL的低IPI分期有关外,其他亚单位的表达与其他临床病理指标,年龄、性别、临床分期、IPI、大块病变、B症状、乳酸脱氢酶水平和病理分型,各组间均无显著差异(P>0.05)。(3)p110α的强阳性表达与PIK3CA的拷贝数扩增正相关(P=0.003),pAKT的中强阳性表达与p110a的强阳性表达正相关(P=0.026)。p110 α,p110β,p110γ和p110δ的强阳性表达与生存期短密切相关(分别是P=0.022,P=0.015,P=0.015和P=0.008)。pAKT中强阳性组病例的预后较差,经过Log-rank检测,两组间未显示显著性差异(P=0.165)。结论：PI3K亚单位蛋白的异常表达与临床预后密切相关,可以作为监测临床预后的指标。p1100的强阳性表达与pAKT的中强阳性表达密切相关,提示可能在AKT的活化中起重要作用。第三部分PI3K催化亚单位沉默对AKT活化及细胞生物学行为影响的体外研究目的：通过体外细胞实验探讨干扰PI3K四个催化亚单位的表达是否改变AKT信号传导通路的活化状态,从而影响DLBCL细胞生长及其他生物学效应。方法：利用RNAi技术,以慢病毒为载体,用含有PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD(?)PIK3CG干扰序列的慢病毒和对照空病毒分别感染LY8细胞,采用流式细胞仪筛选含有绿色荧光(GFP)的LY8细胞,建立稳定转染细胞株(稳转株)。用Westernblot检测稳转株细胞中PI3K四个催化亚单位的表达情况,筛选出沉默效果好的的稳转株。用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的发生情况,用CCK8试剂盒检测细胞的增殖情况,绘制生长曲线。用Western blot检测PI3K下游AKT, pAKT以及细胞周期、细胞凋亡相关蛋白的表达情况。结果：四个催化亚单位PIK3CA, PIK3CB,PIK3CD和PIK3CG干扰之后G1期的细胞比例上升[对照组：37.06%(36.56±2.01)%,实验组：51.4%(50.77±1.45)%,40.82%(46.04±5.58),47.16%(47.12±2.02)和60.40(59.10±1.03)%],处于S期的细胞比例基本不变[对照组：48.96(46.47±2.34)%,实验组：40.36%(42.43±2.57),49.84(45.83±3.93)%,44.53(44.13±0.83)%和30.90(32.87±2.17)%],处于G2期的细胞比例下降[对照组：13.98(16.96±2.79)%,实验组：8.23(6.80±1.34)%,9.34(7.91±1.30)%,8.31(9.37±0.96)%和8.68(7.99±2.04)%]。其中PIK3CA, PIK3CD和PIK3CG与对照组相比发生了明显的G0/G1期阻滞,有显著性差异(P<0.05)。干扰之后各实验组早期凋亡发生率分别为11.5(10.30±1.11)%,9.3(7.83±1.15)%,7.0(6.67±0.35)%和4.7(5.80±1.11)%,对照组为5.7(5.13±0.38)%,发生了明显的早期凋亡,其中PIK3CA, PIK3CB和PIK3CD干扰之后与对照组相比凋亡显著增多,(P<0.05)。生长曲线显示干扰各组均显示细胞增殖减低,其中PIK3CD组增殖降低最为明显,与对照组相比72和96小时增殖具有显著差异(P<0.05)。蛋白检测显示各亚单位AKT的表达不变而pAKT的表达明显减低；细胞周期相关蛋白p27表达升高,cyclinD1表达降低；细胞凋亡相关蛋白bcl-2和PARP未见显著改变结论：干扰PI3K催化亚单位的表达均可以导致AKT活性下降,并可以导致周期阻滞和(或)细胞凋亡,干扰各亚单位的表达能够有效抑制DLBCL细胞的增殖,可能有利于选择性抑制剂发挥其抑制肿瘤生长的效应,成为DLBCL靶向治疗的策略之一。第四部分PIK3CD干扰对人DLBCL移植瘤生长影响的初步研究目的：建立DLBCL裸鼠移植瘤模型,通过体内试验探讨干扰PIK3CD的表达对DLBCL细胞生长及其生物学效应的影响。方法：使用无菌套管针抽吸法建立DLBCL裸鼠皮下移植瘤模型,将裸鼠随机分两组,每组10只,即干扰PIK3CD表达LY8稳转株荷瘤鼠为实验组和转染空病毒LY8稳转株荷瘤鼠为对照组,观察两组的成瘤率,组织形态,肿瘤体积,以及细胞凋亡情况。用IHC检测细胞增殖和细胞凋亡相关蛋白的表达；采用流式细胞技术检测肿瘤细胞的细胞凋亡结果：(1)DLBCL细胞,2周时实验组成瘤率为4/10(40%),对照组成瘤率为7/10(70%),对照组成瘤率高于实验组,有显著性差异(P<0.05)。(2)实验组较对照组肿瘤体积较小,但肿瘤体积无显著性差异(P>0.05)；实验组较对照组裸鼠体重较轻,但裸鼠体重无显著性差异(P>0.05)。(3)实验组较对照组细胞晚期凋亡率高[对照组：6.5(5.87±0.76)%,实验组：18.1(16.07±1.76)%],总凋亡率高[对照组：10.0(10.70±1.04)%,实验组：20.8(17.00±1.49)%],差异均有显著性(P<0.05)。(4)IHC显示实验组较对照组Ki-67和bcl-2阳性表达率减低。结论：通过人DLBCL裸鼠移植瘤模型,体内研究初步显示干扰PIK3CD的表达可通过促进肿瘤细胞凋亡,在一定程度上抑制肿瘤的生长,为PIK3CD抑制剂应用于DLBCL的治疗提供理论依据。