【摘 要】
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前体m RNA的选择性剪接（Alternative splicing,AS）广泛存在于真核生物中,AS事件在中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）中发挥着多种调节作用,如神经细胞分化、神经元迁移、突触形成和大脑发育[1-5]。剪接机制的破坏可导致神经退行性变化[6]。由此可见鉴定中枢神经系统组织中的AS事件和理解其时空与动态调控的重要性。但CNS具有极其复杂的细胞多样
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前体m RNA的选择性剪接（Alternative splicing,AS）广泛存在于真核生物中,AS事件在中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）中发挥着多种调节作用,如神经细胞分化、神经元迁移、突触形成和大脑发育[1-5]。剪接机制的破坏可导致神经退行性变化[6]。由此可见鉴定中枢神经系统组织中的AS事件和理解其时空与动态调控的重要性。但CNS具有极其复杂的细胞多样性,以往的基于群体细胞的AS分析显示了具有异质细胞组成的组织中所有不同细胞的平均值,并不能真正反映该组织中任何具有特定或罕见功能的重要单细胞类型。而基于单细胞的AS分析则能避免这个问题。目前,对神经源性区域重要类型单细胞AS的研究还很少,阻碍了对这些区域AS的生物学作用的理解。成年小鼠前脑室管膜/室管膜下区（SVZ）是已知的神经源性区域之一,该区域包含了与成体神经干细胞（neural stem cells,NSC）活性相关的多种不同的细胞类型[7]。在本论文的研究中,我们对该区域的28个单细胞样本和4个混合细胞样本的转录组数据进行了AS研究,具体的工作和结论如下:1、AS事件的鉴定和分析（1）从28个单细胞样本的1908个基因中鉴定了3611个AS事件,并系统地描述了它们的详细AS特征。通过RT-PCR和Sanger测序验证了随机选择的9个基因的10个AS事件,表明本研究的单细胞RNA-seq对AS的分析是有效的。（2）比较了单细胞样本和混合细胞（10细胞）样本的AS事件数量和剪接类型的差异,结果显示两者之间检测到的AS剪接类型的比例没有显著差异,但在28个单细胞样本中检测到的AS事件（3611个）多于在4个混合细胞样本（共40个细胞）中检测到总AS事件数（3379个）。仅在单细胞样本中检测到的大多数差异表达AS事件（differentially expressed AS events,DEAS）为低丰度和新型剪接亚型,表明在发现罕见剪接亚型方面单细胞转录组测序（Single cell RNA sequencing,sc RNA-Seq）比群体水平更具优势。2、AS事件的异质性和多样性分析（1）比较了静息态神经干细胞（quiescent NSCs,q NSCs）、活化态神经干细胞（activated NSCs,a NSCs）和成神经细胞（neuroblast cells,NEUbs）三种类型细胞的AS事件的数量和剪接类型,并对细胞类型特异性和表达差异作聚类分析,结果显示在三类细胞中AS剪接类型的比例一致,细胞类型特异性的AS事件极少,且在同类型细胞中AS亚型的表达具有高度异质性。（2）随机选择4个分属q NSCs、a NSCs、NEUbs和少突胶质细胞（oligodendrocyte cell,OPCs）的单细胞样本,分析其AS事件和相应的亲本基因,结果显示在单个细胞中同时存在来自同一基因的多个亚型是普遍现象。（3）在单个细胞中检测到了相邻基因的新转录融合和新的双顺反子转录本。3、双顺反子转录本的鉴定和翻译调控机制探究（1）通过RT-PCR、克隆和Sanger测序,验证了Ech1-Lgals4两种新型双顺反子转录本的存在。（2）将两种不同类型的双顺反子转录物克隆到p CMV-N-HA表达载体中,转染HEK293T细胞,以p CMV-N-HA作为对照,Western blot检测过表达细胞中Ech1和Lgals4的表达水平,发现两者的蛋白表达水平仅在过表达含77个核苷酸基因间序列的双顺反子转录本的细胞中高于对照组。表明该顺反子转录物中两基因的开放阅读框（open reading frame,ORF）之间的序列可以驱动Lgals4的表达。（3）在两基因的ORF间序列中找到5个与18Sr RNA互补的短序列,构建7个RFP-ORF间序列-p IRES2’-EGFP重组DNA和三个RFP-ORF间序列-Lgals4基因序列-p IRES2’-EGFP,以RFP-p IRES2-EGFP作为对照。检测过表达的HEK293T细胞中RFP和GFP蛋白的表达情况。推测ORF间序列具有部分内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site,IRES）序列的功能,5个短序列中有2个与核糖体募集呈正相关,3个呈负相关。下游Lgals4基因序列对翻译调控没有直接关联。
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