第一章3种选择培养基用于日本血吸虫细胞培养的研究[目的]探索3种选择培养基对日本血吸虫(Schistosoma japonicum,S.j)细胞作选择培养,观察和鉴定各自对细胞培养的效果,探索通过选择性培养基培养获得单一种类血吸虫细胞的可能性。[方法]分别从感染家兔获取S.j-12d童虫和42d成虫,按常规方法制备细胞。采用生殖类细胞改良培养基对S.j-12d童虫和S.j-42d成虫细胞进行选择培养；同时采用上皮细胞培养基和1640-40综合培养基对S.j-12d童虫细胞进行培养。观察日本血吸虫细胞经这3种选择培养基培养后-般生长状况和形态特点；通过染色体核型分析、AKP染色、超微结构观察对培养细胞进行鉴定；利用BrdU掺入法或3H-TdR掺入法检测部分培养细胞的增殖能力,以及运用Dot-ELISA方法检测培养细胞的抗原性。[结果]日本血吸虫细胞经这3种选择性培养基培养后,均有不同程度的增殖,细胞分裂相明显,并且细胞活力状态良好。经生殖类细胞改良培养基培养的童虫和成虫来源细胞在早期分裂现象明显,呈葡萄串样生长繁殖,形成细胞团；第3周可见大量形态结构相近的细胞呈半贴壁生长状态。对培养细胞进行鉴定发现细胞有DNA合成,染色体具有单倍体和双倍体两种核型；AKP染色为强阳性,超微结构鉴定可见胞质中含有大量囊泡状小体,此为生殖类细胞的特征之一；培养4周细胞开始出现退化死亡。日本血吸虫童虫细胞经上皮细胞培养基培养后的鉴定结果显示：培养3d的细胞出现类上皮样细胞生长,培养1周呈半贴壁生长；细胞形态多呈长梭形,结构完整,核质分明,细胞核清晰可见,核仁明显；超微结构显示细胞膜完整,细胞器无扩张、水肿现象,核仁和核膜清晰；并且童虫细胞成分能被血吸虫细胞免疫血清所识别。根据细胞的形态特征和抗原性,初步认为经上皮细胞培养基培养的童虫细胞为上皮类细胞。用1640-40综合培养基培养的日本血吸虫细胞经鉴定后结果显示：培养细胞分裂相多样,培养早期(30d)细胞状态和活力较好,增殖相明显；超微结构观察显示培养30d细胞形态结构基本正常,进行细胞活力检测达到70%；细胞增殖试验结果显示细胞具有一定的增殖能力；染色体分析符合血吸虫二倍体核型；对细胞进行冻存复苏发现基本保持细胞原有的特性和活力。[结论]日本血吸虫混合细胞经生殖类细胞改良培养基和上皮细胞培养基培养后,能使混合细胞中类似生殖类细胞和上皮细胞进行选择性增殖,并具有该类特定细胞的部分标志性特征,可以达到初步分选细胞的目的,但连续培养时间不长。1640-40综合培养基能明显促进细胞增殖,改善细胞生长状态,延长细胞在体外的存活时间。第二章SV40大T抗原基因重组腺病毒转染日本血吸虫童虫与其细胞后的效果观察[目的]构建含SV40大T抗原(SV40LT)基因的重组腺病毒表达载体,观察重组腺病毒转染日本血吸虫童虫及童虫细胞后SV40LT基因的表达情况,探讨重组腺病毒载体转染日本血吸虫童虫和童虫细胞的可能性,观察转染的外源SV40LT基因对童虫和童虫细胞生长状况以及细胞增殖的影响。[方法]将国外赠送的携带SV40LT基因的重组腺病毒质粒(AdHu5-SV40LT)采用热休克法重新转化Stbl2感受态菌,获得重组腺病毒质粒。对质粒用限制性内切酶酶切、PCR扩增法进行鉴定。鉴定正确后的质粒经Pac I酶切线性化后用脂质体共转染293A细胞,待出现细胞病变效应(cell pathological effect, CPE)后收集细胞,经反复冻融细胞离心收集细胞裂解上清,用氯化铯超速离心法对病毒上清进行浓缩和纯化,获得具有感染性的重组腺病毒(Ad-SV40LT)。采用50%细胞培养感染法(50%cell culture infectious dose,CCID50)测定腺病毒的滴度。日本血吸虫尾蚴常规感染家兔获得12d童虫,一部分用改良841培养基培养,另一部分按常规方法制备细胞,添加1640-40综合培养基培养。两者均培养3d后用重组腺病毒进行转染,继续培养6-10d分别收集虫体和细胞,通过PCR、RT-PCR、 Western blotting和免疫组织化学方法检测转染童虫及童虫细胞中SV40LT基因的转录和表达情况。[结果]转化Stbl2感受态菌后提取的AdHu5-SV40LT质粒绎Pac Ⅰ酶切和PCR鉴定为日的质粒。质粒成功转染293A细胞并可在293A细胞内进行有效的复制；从转染293A细胞裂解上清中提取病毒DNA进行PCR检测证实含有SV40LT目的基因；同时Western blotting结果显示在质粒转染的293A细胞中有SV40LT蛋白的表达；免疫组织化学染色也证实了同样的结果。腺病毒转染的293A细胞裂解上清经氯化铯超速离心浓缩后测得病毒滴度为2.6×109cfu/ml。常规制备的S.j-12d童虫细胞用1640-40综合培养基培养3d后可见细胞生长状态良好,部分细胞分裂相明显。用重组腺病毒转染的S.j-12d童虫及童虫细胞经PCR检测均扩增出了外源SV40LT基因558bp的目的产物,进一步用RT-PCR也证实了有目的基因mRNA的转录表达；Western blotting检测结果显示重组腺病毒转染的童虫及其细胞内有SV40LT蛋白的表达；免疫组织化学染色检测也证实在虫体被膜下、口腹吸盘以及童虫细胞内均有该蛋白的表达。病毒转染后童虫活力未受影响,而童虫细胞转染初期增殖较快,此后生长逐渐减慢,细胞出现崩解、死亡。[结论]用质粒AdHu5-SV40LT和脂质体共转染293A细胞后,成功获得了具有感染能力的携带外源SV40LT基因的腺病毒；重组腺病毒转染日本血吸虫童虫及童虫细胞后有目的基因SV40LT的转录和蛋白表达,但转染的外源SV40LT基因未能使童虫细胞获得无限增殖能力而达到细胞永生化。本实验结果表明腺病毒能转染日本血吸虫童虫及童虫细胞,并能将外源基因成功导入,为血吸虫的转基因研究提供实验依据。