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目的短链酰基辅酶A脱氢酶(Short-chain acyl-Co A dehydrogenase,SCAD)是脂肪酸氧化的关键酶,在心脏的发育发展中起着重要的作用。SCAD能够特异性地分解底物短链酰基辅酶A,是脂肪酸β氧化中的第一个限速酶。本课题旨在研究SCAD在心肌细胞凋亡中的变化,探讨腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)/过氧化物酶体增殖剂活化受体α(peroxisome proliferatoractivated receptorα,PPARα)/SCAD信号途径对心肌细胞凋亡的调控作用,为确立SCAD作为心肌细胞凋亡的新靶点提供理论依据。方法1.采用叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,t BHP)刺激原代心肌细胞,建立心肌细胞凋亡模型。检测心肌细胞存活率和SCAD的m RNA、蛋白表达变化。2.采用SCAD最优干扰序列siRNA-1186,检测siRNA-1186刺激心肌细胞后,SCAD的表达量、酶活性的改变以及脂质代谢的变化,同时检测心肌细胞凋亡指标,细胞存活率,细胞凋亡率,细胞凋亡蛋白caspase3、Bcl-2、Bax的变化,并与t BHP诱导的心肌细胞凋亡模型相比较。3.采用PPARα激动剂非诺贝特(Fenofibrate,Feno)(10μM)预处理30 min后,再以t BHP或siRNA-1186刺激心肌细胞。检测PPARα和SCAD的m RNA、蛋白表达变化,SCAD酶活性变化,心肌细胞游离脂肪酸和ATP含量变化,同时检测心肌细胞凋亡指标,细胞存活率,细胞凋亡率,细胞凋亡蛋白caspase3、Bcl-2、Bax的变化。4.采用AMPK激动剂AICAR(0.5m M)预处理30 min后,再以t BHP刺激心肌细胞。检测磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α(p-AMPKα)、PPARα和SCAD的表达量变化,SCAD酶活性变化,心肌细胞游离脂肪酸和ATP含量变化,同时检测心肌细胞凋亡指标,细胞存活率,细胞凋亡率,细胞凋亡蛋白caspase3、Bcl-2、Bax的变化。结果1.MTT结果显示:心肌细胞存活率随t BHP浓度的变化和时间的延长呈依赖性下降,且在t BHP浓度为200μM,作用时间为6h时,细胞存活率为50%。Western Blot和RT-PCR结果显示,在t BHP浓度为200μM,作用时间为6h和8h时,SCAD的表达量下降更为显著。2.SiRNA-1186或t BHP刺激的心肌细胞中SCAD的表达量显著下调,酶活性显著下降,游离脂肪酸含量明显升高,ATP含量明显降低;与此同时,siRNA-1186能诱导心肌细胞存活率显著下降,细胞凋亡率显著升高,细胞凋亡蛋白caspase3和Bax显著增加,Bcl-2显著下降,这与t BHP诱导的心肌细胞凋亡趋势一致。3.与siRNA-1186组相比,Feno+siRNA-1186组中SCAD和PPARα的表达量均显著上调,酶活性显著升高,游离脂肪酸含量明显下降,ATP含量明显升高;与t BHP组相比,Feno+t BHP组中SCAD和PPARα的表达量亦明显上调,酶活性显著升高,游离脂肪酸含量明显下降,ATP含量明显升高;且Feno预处理后细胞存活率明显升高,细胞凋亡率下降,细胞凋亡蛋白caspase3和Bax显著下降,Bcl-2显著升高。4.与t BHP组相比,AICAR+t BHP组中SCAD、PPARα和p-AMPKα的表达量均上调,酶活性显著升高,游离脂肪酸含量明显下降,ATP含量明显升高;且AICAR预处理后细胞存活率明显升高,细胞凋亡率下降,细胞凋亡蛋白caspase3和Bax显著下降,Bcl-2显著升高。结论SCAD的表达失调与心肌细胞凋亡密切相关,AMPK/PPARα/SCAD信号通路介导了SCAD对心肌细胞凋亡的调控作用,SCAD可能作为心力衰竭药物治疗的新靶点。