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研究背景与目的:糖和脂是我们日常饮食生活必需的,但摄入过多会对人们的身体产生负担,这就造成了很多包括肥胖、心血管疾病在内的“健康杀手”乘机而入。自噬是一个吞噬自身受损和无用的蛋白质或细胞器,并使其包被进入囊泡后与溶酶体形成自噬溶酶体,然后降解所包裹内容物产生氨基酸和脂肪酸的过程,以此实现细胞的内环境稳态。自噬在生理和病理过程中都可发生,但其所产生的作用还未阐明。柚皮苷(Nar)作为一种黄酮类化合物,具有降低血浆胆固醇、减少血栓形成和改善局部微循环和营养供给等多种药理作用。然而,在高糖和高脂(HG/HF)应激下,柚皮苷对血管内皮细胞功能和自噬的影响尚不清楚。本课题目的是观察Nar对HG/HF应激下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)功能和自噬的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:本实验以HUVECs为实验对象,采用不同浓度的葡萄糖/棕榈酸处理HUVECs来建立HG/HF诱导内皮细胞功能损伤模型,先测定正常组和受损组的细胞功能和自噬水平,以此判断HG/HF应激对细胞功能和自噬的影响。然后在功能受损组的基础上加入低(43μM)、中(86μM)、高(172μM)浓度的Nar,测定Nar的加入对细胞功能和自噬带来的影响。接下来,用自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理细胞,比较不同组细胞的功能水平,以此判断细胞功能和自噬之间的关系。最后分别在PI3K、Akt和mTOR抑制剂的处理下探究Nar作用的分子机制。实验分为对照(Control)组、溶媒(Vehicle)组、HG/HF组、Nar组、自噬抑制剂组和通路抑制剂组,采用HE染色观察细胞形态和数量的变化;Western blot法检测p-eNOS/eNOS、LC3-II/I、p62、Beclin1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR等蛋白水平的表达;分光光度法检测一氧化氮(NO)和乳酸脱氢酶(LDH)水平;ELISA法检测内皮素(ET-1)水平;流式细胞仪检测活性氧(ROS)水平;MDC染色检测自噬小体水平;细胞划痕实验检测细胞增殖和迁移功能;Transwell法检测细胞浸润功能等。结果:1.HUVECs在HG/HF应激下,随着HG/HF处理浓度和时间的增加,HE染色结果显示,细胞形态逐渐受损、细胞数量逐渐减少;MTT结果也显示了细胞活力在逐渐降低;流式细胞仪结果显示,HG/HF浓度的增加会使细胞内的ROS含量也增加;酶标仪结果也显示出了NO含量水平的下降,提示HG/HF应激会给细胞带来损伤甚至死亡。Western blot结果得出,受HG/HF应激的影响,p-eNOS/eNOS表达显著下调,自噬关键蛋白LC3-II/I和Beclin1表达显著上调,p62表达显著下调,显微镜下也观察到了自噬小体数量的增加,说明HG/HF应激会诱导细胞发生自噬。本实验以44/1.0 mM的HG/HF处理细胞24 h作为最佳功能受损组,MDC染色法结果显示此时细胞的自噬水平也显著增加,因此也称最佳自噬(OA)组。2.HG/HF应激下的HUVECs在加入不同浓度Nar的作用下,细胞划痕实验显示,细胞增殖和迁移能力显著提高;流式细胞仪结果显示,细胞内ROS含量减少;分光光度法测得NO含量增加、ET-1含量减少,并且以上的实验都在中浓度Nar的加入下影响最明显,说明HG/HF应激下的HUVECs在加入Nar的作用下细胞功能得到改善,且选用中浓度的Nar改善的最为显著。Western blot结果显示,p-eNOS/eNOS表达显著上调,LC3-II/I和Beclin1表达显著下调,p62表达显著上调,与MDC染色结果显示的自噬小体数量减少共同说明Nar会抑制HG/HF应激下的HUVECs自噬。因此,本实验以中浓度Nar作用细胞24 h作为最佳的Nar组,即ON组。3.Transwell实验表明,在OA组和OA+ON组基础上加入自噬调节剂,自噬诱导剂RAPA会降低细胞的渗透浸润功能,而自噬抑制剂3-MA会增加细胞的渗透浸润功能;LDH实验表明,自噬诱导剂RAPA的加入会增加细胞内的LDH含量,而自噬抑制剂3-MA会减少细胞内的LDH含量。以上结果显示出自噬诱导剂会部分取消Nar对HG/HF应激下HUVECs功能的改善作用,而自噬抑制剂则会增加Nar的这种保护性作用,表明自噬负调控细胞功能。4.Western blot结果显示,相比于OA组,OA+ON组的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR的表达显著上调,说明Nar的加入激活了PI3K-Akt-mTOR通路。而且,在PI3K,Akt和mTOR通路抑制剂的作用下,自噬相关蛋白LC3-II/I和Beclin1表达显著上调,p62表达显著下调,表明此通路的抑制会削弱Nar对自噬的下调,进一步证实了Nar是通过激活PI3K-Akt-mTOR通路来发挥抑制自噬的作用。另外,通路抑制剂的加入使得p-eNOS/eNOS表达显著下调,ROS含量显著增加,说明Nar是通过激活PI3K-Akt-mTOR通路来发挥改善细胞功能的。结论:Nar通过激活PI3K-AKT-mTOR通路抑制自噬,改善HG/HF应激下的HUVECs功能。