研究背景和目的随着社会经济的发展,人民生活水平的提高,居民饮食结构的改变,结直肠癌已成为世界范围内最常见的一种消化系统肿瘤。近年来伴随科学技术的发展,结直肠癌的诊疗已取得了很大进步,然而,其发病率和死亡率仍较高。目前,结直肠癌的转移和复发是导致死亡的主要原因。因此,关于结直肠癌发生和转移机制的研究对于患者的早期筛查、临床治疗和生存预后都具有十分重要的意义。视黄酸受体γ(RARγ)作为核受体超家族中的一员,其在介导细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程中发挥着重要的作用。然而其在结直肠癌发生发展中的作用及调控机制尚不清楚。Hippo通路能够调控细胞的增殖和凋亡,其在控制组织器官的发育以及维持组织器官的大小等方面发挥着极其重要的作用。近年来越来越多的研究表明,Hippo信号通路的异常与肿瘤的发生发展紧密相关。Yap作为Hippo信号通路中的关键效应分子,其在肿瘤细胞中异常的表达及活性会驱动肿瘤细胞的生长及转移。然而,Hippo-Yap信号转导在结直肠癌中的调控机制仍有待进一步探讨,Hippo-Yap信号转导与核受体之间是否存在某种关联仍有待研究。在本研究中,我们旨在研究视黄酸受体RARγ在结直肠癌发生发展过程中的作用;阐明RARγ通过与Hippo-Yap信号转导的交互作用介导结直肠癌生长和转移的分子机制;以期明确RARγ/Hippo-Yap信号转导新机制在结直肠癌中的作用及临床意义。研究方法1、Western blot检测RARγ在人结直肠癌组织和细胞中的表达情况;2、免疫组化分析RARγ的表达量与肿瘤、远端转移和预后情况的相关性;3、利用逆转录病毒载体构建稳定敲低RARγ的细胞株,用质粒载体构建过表达RARγ的细胞株;RARγHippo-Yap4、通过MTT和平板克隆实验检测细胞增殖能力的变化;5、使用Transwell细胞转移实验来检测细胞的迁移和侵袭的能力变化;6、运用裸鼠皮下成瘤和肺转移模型研究肿瘤细胞的体内变化;7、利用免疫荧光和细胞亚组分蛋白分离技术研究蛋白在细胞中的定位;8、荧光素酶报告系统检测RARγ对于Hipoo-Yap信号通路的作用关系;9、运用RT-PCR的方法检测通路下游基因的表达变化;10、利用免疫共沉淀的方法研究蛋白质之间的相互作用;研究内容第一节检测RARγ在人临床结直肠癌组织标本中的表达对人结直肠癌配对的临床标本组织进行Western blot的检测,发现其中78%的RARγ高表达于癌旁组织中;免疫组化的结果也同样发现,RARγ在癌旁组织中的表达高于结直肠癌组织,并且RARγ在癌组织中的表达量与结直肠癌患者的肿瘤体积、远端转移和预后优良密切相关。第二节RARγ的缺失对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响构建并筛选了稳定敲低RARγ的SW480和HT-29细胞株;MTT的实验结果显示,稳定敲低RARγ的结直肠癌细胞SW480与对照组细胞相比体外增殖能力升高;平板克隆实验结果显示,稳定敲低RARγ的结直肠癌细胞SW480与对照组细胞相比体外形成克隆能力升高;Migration实验表明,稳定敲低RARγ的结直肠癌细胞SW480与对照组细胞相比体外迁移能力增加;Invasion实验表明,稳定敲低RARγ的结直肠癌细胞SW480与对照组细胞相比体外侵袭能力增加;裸鼠皮下成瘤实验结果显示,稳定敲低RARγ的结直肠癌细胞SW480与对照组细胞相比体内肿瘤生长能力增加;裸鼠肺转移实验结果显示,稳定敲低RARγ的结直肠癌细胞SW480与对照组细胞相比体内肺转移灶个数增加。第三节RARγ的过表达对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响构建并筛选了稳定过表达RARγ的DLD-1和RKO细胞株;平板克隆实验结果显示,过表达RARγ的结直肠癌细胞DLD-1和RKO均比对照组细胞体外形成克隆数目减少;Migration实验表明,过表达RARγ的结直肠癌细胞DLD-1和RKO均比对照组细胞体外迁移能力下降;Invasion实验表明,过表达RARγ的结直肠RARγHippo-Yap癌细胞DLD-1与对照组细胞相比体外侵袭能力下降;裸鼠皮下成瘤实验结果显示,稳定过表达RARγ的结直肠癌细胞DLD-1与对照组细胞相比体内肿瘤生长能降低;裸鼠肺转移实验结果显示,稳定过表达RARγ的结直肠癌细胞DLD-1与对照组细胞相比体内肺转移灶个数下降。第四节RARγ通过改变Yap蛋白的磷酸化进而影响结直肠癌细胞的增殖和转移Western blot结果显示,稳定敲低RARγ的人结直肠癌细胞SW480和HT-29中Yap的磷酸化水平降低;反之,过表达RARγ的人结直肠癌细胞DLD-1和RKO中Yap的磷酸化水平升高;稳定敲低RARγ的细胞SW480形成的裸鼠皮下瘤中Yap的磷酸化水平低于对照组细胞形成的皮下瘤;RARγ对Yap磷酸化的改变受到ATRA的调节;免疫荧光、免疫组化和细胞亚组分的分离等三个实验都提示,在稳定敲低RARγ的SW480细胞中Yap更多的定位于细胞核;荧光素酶报告系统的结果显示,在SW480和RKO两种肿瘤细胞中过表达RARγ会降低Yap-TEAD的转录活性;相比之下,在SW480中敲低RARγ会升高Yap-TEAD的转录活性;RT-PCR的实验结果显示,在稳定敲低RARγ的SW480细胞中,Hippo通路下游的基因AREG和CTGF都有显著地上调表达。第五节RARγ通过依赖Yap的途径调节细胞的上皮间质转换(EMT)过程RT-PCR和Western blot的实验结果显示,相比于对照组细胞,稳定敲低RARγ的SW480细胞中E-cadherin表达下调,Vimentin表达上调;反之,在过表达RARγ的DLD-1细胞中E-cadherin表达上调,Vimentin表达下调;Western blot也检测到同时干扰Yap后,上述结果会出现进一步的显著改变;Migration结果显示,稳定敲低RARγ的SW480细胞再同时干扰Yap会降低由于RARγ缺失引起的细胞迁移;Invasion结果显示,稳定敲低RARγ的SW480细胞再同时干扰Yap也会降低由于RARγ缺失引起的细胞侵袭。第六节RARγ能够与Yap发生相互作用免疫荧光结果显示,高表达RARγ的结直肠癌细胞株SW480和HCT116中RARγ也存在于细胞质之中;免疫共沉淀和免疫荧光实验表明,无论是内源性还是外源性的RARγ和Yap都会相互作用,并且这种相互作用受到ATRA的调节;通过RARγ和Yap的缺失突变体的研究表明,RARγ蛋白质中的LBD段结构域和RARγHippo-Yap Yap蛋白质中102-263的氨基酸段是两者的结合区域;RARγ引起的Yap磷酸化升高是因为RARγ能够促进Lats1与Yap相互作用,进而上调Yap的磷酸化。第七节肿瘤组织中RARγ的表达与E-cadherin呈现正相关,与Vimentin和CTGF呈现负相关通过Spearman秩相关分析RARγ、E-cadherin、Vimentin和CTGF在人结直肠癌临床组织标本中的表达情况发现,RARγ的表达与E-cadherin呈现正相关,与Vimentin和CTGF呈现负相关。