论文部分内容阅读
虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）是冷水性贝类,适宜生长温度约为15℃,能够耐受的温度范围为5-23℃,。近年来,随着全球气候变暖,我国北黄海夏季海水温度经常超过23℃,严重影响了虾夷扇贝的生长、繁殖和生存,导致夏季大规模死亡事件时常发生。虾夷扇贝通过激活复杂的胞内应激调控网络来应对环境胁迫,其中,未折叠蛋白反应（Unfolded protein response,UPR）和糖原代谢调节是贝类响应和适应高温胁迫等的重要机制。在内质网应激条件下,UPR能促进蛋白质的正确折叠,并清除错误折叠或非折叠蛋白,以促进细胞恢复稳态;当内质网应激过于强烈或者持续时间过长时,UPR转换下游调控模式促进细胞凋亡。研究发现,糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3 beta,GSK-3β）在糖原代谢和内质网应激引起的细胞凋亡中发挥重要的调节作用。本研究拟利用生物信息学和分子生物学等相关技术对虾夷扇贝GSK-3β（命名为PyGSK-3β）在高温胁迫条件下调节糖原代谢和细胞凋亡的功能进行初步研究,主要结果如下:虾夷扇贝PyGSK-3β的cDNA全长为3772 bp,开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）长为1257 bp,编码一段含有419个氨基酸的多肽。利用SMART软件进行结构域预测发现,PyGSK-3β含有保守的丝苏氨酸激酶结构域。利用Clustal W软件进行多序列比对,结果发现,PyGSK-3β第9位丝氨酸（Ser9）和第216位酪氨酸（Tyr 216）的磷酸化位点与其他脊椎动物和无脊椎动物PyGSK-3β相比进化保守。利用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）技术检测PyGSK-3β基因的表达水平,结果发现,PyGSK-3β在鳃、性腺、血淋巴细胞、外套膜、肝胰腺和闭壳肌中均有表达,其中在外套膜中的表达量最高,大约是血淋巴细胞中的231.67倍（p<0.05）。高温胁迫（25℃）6 h后,虾夷扇贝鳃中的PyGSK-3βm RNA表达水平显著上升（为空白组的3.43倍,p<0.05）。利用q RT-PCR技术和商品化试剂盒检测了高温胁迫后虾夷扇贝鳃组织中糖原代谢相关基因的表达水平、糖代谢关键酶的活性变化和糖代谢产物的含量。结果发现磷酸果糖激酶（Phosphofructokinase,PFK,命名为PyPFK）、糖原磷酸化酶a（Glycogen phosphorylase a,GPa,命名为PyGPa）、柠檬酸合酶（Citrate synthase,CS,命名为PyCS）、磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶（Phosphoenol Pyruvate carboxylate kinase,PEPCK,命名为PyPEPCK）和糖原合成酶（Glycogen synthase,GCS,命名为PyGCS）的m RNA表达量均在高温胁迫1 h后显著下降（p<0.05）。丙酮酸激酶（PK,命名为PyPK）的m RNA表达量在高温胁迫6 h后显著上升（为空白组的16.32倍,p<0.05）。GPa活性在高温胁迫1 h和12 h后显著上升,分别为空白组的1.93倍和2.33倍（p<0.05）,PK活性在高温胁迫1 h和12 h后与24h相比显著下降（p<0.05）,ATPase活性在高温胁迫6 h后达到最高（为空白组的2.46倍,p<0.05）。乳酸含量在高温胁迫3 h和24 h后显著上升,分别为空白组的1.74倍和2.17倍（p<0.05）。高温胁迫24 h后鳃中糖原含量较1 h、6 h和12 h显著下降（p<0.05）。上述结果表明,高温胁迫下虾夷扇贝的糖原合成受到了抑制,主要依靠糖原的无氧糖酵解途径为贝类的高温胁迫应答提供能量。利用q RT-PCR、Western blot和组织免疫化学技术检测了高温胁迫下UPR和凋亡相关蛋白、GSK-3β抑制剂处理后高温胁迫下UPR和凋亡相关指标的变化。结果发现,高温胁迫3 h后,葡萄糖调节蛋白78（Glucose-regulated protein 78,GRP78,命名为PyGRP78）在鳃中的m RNA表达水平显著上升（空白组的1.89倍,p<0.05）;6 h后UPR关键接头分子肌醇依赖性激酶1α（Inositol requiring enzyme 1α,IRE1α,命名为PyIRE1α）在鳃中的m RNA表达水平显著上升（空白组的17.45倍,p<0.05）,提示IRE1α信号通路被激活,以此来缓解高温胁迫应答早期内质网应激压力。高温胁迫3 h后,鳃中B淋巴细胞瘤-2（BCL-2,命名为PyBCL-2）m RNA表达水平显著上升,为空白组的2.37倍（p<0.05）;高温胁迫6 h后,c-jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase,JNK,命名为PyJNK）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3,命名为PyCaspase-3）的m RNA表达水平均显著上升,分别为空白组的3.01倍（p<0.05）和15.08倍（p<0.05）,而PyBCL-2在鳃中的m RNA表达水平显著下降（空白组的0.35倍,p<0.05）。这些结果提示,当高温胁迫时间持续到6 h时,内质网应激压力造成的细胞损伤超出UPR的修复范围,UPR转换下游调控模式促进细胞凋亡。高温胁迫下PyGSK-3β（Tyr 216）和PyJNK的磷酸化水平升高,其中,PyGSK-3β磷酸化水平在高温胁迫6 h达到最高,PyJNK磷酸化水平在高温胁迫1 h和6h升高。上述结果表明,UPR通过激活下游PyGSK-3β进而活化PyJNK调节凋亡相关分子的表达。利用GSK-3β抑制剂（SB216763）抑制PyGSK-3β的表达后进行高温胁迫处理,结果发现,高温胁迫6 h后,PyGRP78、PyJNK和PyCaspase-3的m RNA表达水平显著下降（p<0.05）,而抗凋亡分子PyBCL-2的m RNA表达量无显著变化;PyGSK-3β和PyJNK磷酸化水平相较于抑制剂处理前显著降低。免疫组织化学结果显示,高温胁迫下,GSK-3β抑制剂（SB216763+heat）处理组中绿色荧光凋亡信号较DMSO+heat处理组显著减少。以上研究结果表明,高温胁迫条件下,虾夷扇贝主要依赖糖原的无氧糖酵解为机体提供能量。内质网应激诱导UPR,激活PyGSK-3β,进而调节PyJNK的磷酸化水平,介导细胞凋亡。研究结果为深入研究贝类高温胁迫应答机制奠定了基础,也为研发贝类夏季大规模死亡防控技术、培育耐高温新种质提供了一定的参考。