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细胞因子是免疫和造血系统中细胞间的信号传递分子。这些因子通过与靶细胞上的特异性受体结合来表达其生物功能。细胞因子作用于受体的一个重要结果是诱导基因表达，细胞膜上的受体接收特定的来自胞外的信号刺激后将这种信号传至胞内，产生一系列新的信号分子和有序的系列化级联反应，最终对细胞乃至整个生物体的生理功能产生影响。白细胞介素-6（IL-6）是一种多功能的细胞因子，对造血干细胞，淋巴细胞，巨核细胞，肝细胞具有促进生长、诱导分化的功能。其作用于敏感细胞时，必将导致一些基因的表达，克隆这些基因，必将有助于进一步阐明IL-6信号转导途径及信号分子的作用机制，同时也将有助于进一步阐明IL-6与某些疾病的相关性。 1．IL-6相关EST的电子克隆，候选新基因的钓取及生物信息学分析 利用Siclone软件包对5个本研究室保存的在Genebank上注册的IL-6作用相关的EST进行了电子克隆，获得了五个全长cDNA序列，依据实验工作号分别命名为E-LX1、E-LX2、E-LX3、E-LX4、E-LX5。利用Goldkey软件对EST及电子克隆（E-clone）结果进行比对分析，明确EST在eclone中的插入部位及其相似率，以判断EST序列是否被有效克隆。同时通过BLAST对这五个全长cDNA的序列进行相似性检索及可读框架（ORF）分析。结果表明4个EST获得了有效延伸。其中LX1和LX3的全长cDNA是具有开放阅读框架的功能未知新基因；而LX2的EST序列在电子克隆延伸所获得的全长cDNA中仅保存了44.61％的一致性，为电子克隆的误判结果或无法延伸，没有研究的意义；LX4为非编码区；LX5可能为内含子。值得注意的是LX3为符合极典型有效翻译特征（Kozak规律）的全长cDNA功能未知基因。进一步信息学分析显示由它编码的308个氨基酸序列中含有ASP富含区和EFHAND2结构及多个PKC（蛋白激酶C）磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，酪氨酸激酶磷酸化位点，N-十四酰化位点。分析显示它是外周结合蛋白超家族博士学位论文中文摘要激酶磷酸化位点，N一十四酞化位点。分析显示它是外周结合蛋白超家族的一个新成员，与该家族中的ZGBP最接近，推测其可能具有刺激淋巴细胞增殖及增加外周血淋一巴细胞内钙的浓度等功能。 通过RT一PCR的方法，我们在国际上首次从IL一6诱导sh的人U937细胞中成功钓取了功能未知新基因LX3。DNA序列测定表明通过分子生物学实验钓取的LX3基因与电子克隆所获得的E一Lx3基因相似性达99.68%。而在同样培养条件但无IL一6诱导及TNF诱导的的U937细胞中没有钓取到该基因，初步说明我们钓取的Lx3是与IL一6诱导相关的新基因。2.功能未知新基因LX3的表达特征分析及细胞定位的研究 为进一步研究LX3基因与IL一6作用的相关性，采用半定量RT一PCR法分别对Lx3与工L一6进行了不同作用时间和不同IL一6作用剂量的研究，结果时间表达谱和剂量表达谱都显示了LX3和IL一6的作用密切相关。 为对新基因进行研究，确定新基因在多组织中的表达状态，对基因进行功能预测分析是必要的。我们用随机引物法制备了用32P标记Lx3的全长cDNA探针，进行了LX3基因的多组织核酸分子膜杂交即Northernblot。结果显示:LX3基因在脑、心、肝、肺、脾、翠丸、骨骼肌等人体八种组织中皆有不同程度的表达，其中在肇丸和脾脏中表达较高，而在脑、胃中表达相对较低。由于脾脏为淋巴细胞生发中心，而Lx3基因在脾脏中高表达，提示我们该基因很可能与淋巴细胞的增殖与分泌的某些功能相关;同时Lx3蛋白质在人肇丸组织中的高表达，提示该转录本可能与男性生殖腺的某些功能相关。 为进一步研究LX3基因编码蛋白质的表达特征，我们进行了LX3编码蛋白质在细胞中的分布状态（即细胞的位）定位研究。构建了表达绿色荧光蛋白的真核融合表达质粒pEGFP一Nl/LX3，采用Lipofectin试剂转染真核细胞293T、NIH3T3，通过Confocal共聚焦荧光显微镜观察细胞内LX3一GFP的荧光分布，以判断该融合分子在细胞内的定位情况，结果表明LX3编码的蛋白质为全细胞分布。3.人功能未知新基因LX3的原核表达、纯化及功能的初步研究。为验证生物信息学及实验生物学预测的LX3基因表达蛋白质的可能 3博l学位论文中文摘要功能。构建了克隆载体pGEM一T easy/LX3，DNA测序正确后亚克隆到带有6个His标签的原核高效融合表达载体pET28a（+）上，并转化大肠杆菌BL21和JMIOg。进行了pET28a（+）/Lx3的融合表达研究及表达条件的优化。结果表明在20℃，0.Zllunol/L IPTG条件下诱导12h时LX3的表达量最高，表达量达到20%，且为可溶性表达。 利用融合表达重组LX3蛋白有His纯化标签的特点，我们采用TALON钻离子亲和层析柱，对重组蛋白LX3进行了纯化。结果表明在平衡缓冲液Extraetion/Wash Bufl七r为50mmol/L PB+500 mmol/L NaCI（PH7.0），而洗脱缓冲液Elution Buffer是SOmmol/L PB+500枷01/L NaCI+150Inlnol/L咪哇（PH 7.0）;平衡速度为smU而州cm，洗脱速度为0.5一1.0ml/mi可cm的条件下，获得了较纯的的蛋白质。纯度达90%以上。 在Lx