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目的:溃疡性结肠炎为慢性非特异性结肠炎症,属中医“泄泻”范畴,为现代难治性疾病之一。发病机制至今不明,全世界范围内逐年增长的发病率使研究其病因及发病机制尤为重要。中药大黄、巴豆霜配伍作为止泻对药,广泛应用于急慢性腹泻的治疗。本实验前期研究表明,单品小剂量巴豆霜、巴豆霜与大黄按一定比例配伍具有明确止泻功效。已有报道,包含大黄、巴豆霜配伍的中成药对UC临床治疗效果明显,但其配伍对溃疡性结肠炎作用机制尚鲜见报道,且大黄、巴豆霜二者具有多成分、多靶点和多样性的特点,作用机理及物质基础的阐明一直处于瓶颈状态。因此,本课题以TNBS/乙醇诱导大鼠溃疡性结肠炎及H2O2诱导IEC-6细胞凋亡模型,选择巴豆霜乙醇粗提物、大黄组要成分大黄素、没食子酸作研究对象,用以探讨传统药对药理作用机制及在溃疡性结肠炎治疗中作用,明确大黄、巴豆霜的有效物质基础。方法:1.以TNBS+乙醇灌肠诱导溃疡性结肠炎大鼠模型。2.以前一实验结果为基础,从免疫学角度,探讨溃疡性结肠炎发病机制,研究大黄、巴豆霜治疗作用。Wister雄性大鼠随机分为模型组、大黄+巴豆霜配伍组、巴豆霜与大黄成分配伍组(巴豆霜+大黄素组、巴豆霜+没食子酸组),正常对照组。造模后第4天,各治疗组连续灌胃给药7天,每日1次。11天处死大鼠,采集新鲜血、血清、结肠组织标本。流式细胞术检测大鼠外周血CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3的变化;酶联免疫吸附试验测定血清IL-6、IL-10含量;免疫组织化学检测肠粘膜ICAM-1、COX-2的表达情况。3.在细胞水平上研究不同浓度巴豆霜乙醇粗提物、没食子酸、大黄素在H2O2诱导IEC-6细胞凋亡中的作用。血清饥饿的IEC-6细胞被分为不同处理组,空白对照组;200μmol/LH2O2处理组;不同浓度巴豆霜乙醇粗提物与没食子酸、大黄素分别配伍预处理细胞后再以H2O2刺激组。MTT法检测细胞增殖,DNA片段的琼脂糖凝胶电泳、TUNEL法及流式细胞仪检测凋亡。Western blot检测各组Caspase-3蛋白表达情况。结果:1.清洁级环境条件下,成功建立溃疡性结肠炎模型。TNBS100mg/kg+50%乙醇浓度大鼠第二天均出现腹泻、血便、脓血便,肠粘膜充血、水肿,光镜条件下,可见大量炎性细胞浸润,且死亡率低。2.与正常对照组比较,模型组大鼠外周血CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3含量降低;细胞因子IL-6浓度升高,IL-10浓度降低;粘膜ICAM-1、COX-2的表达升高(P<0.05)。大黄+巴豆霜配伍组、巴豆霜+没食子酸组可升高大鼠外周血CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3的含量;IL-6浓度降低,IL-10浓度升高,ICAM-1、COX-2的表达明显降低,差异具有显著性(P<0.05)。而巴豆霜+大黄素配伍组和模型组比较无统计学意义(P>0.05)。3.MTT实验显示:巴豆霜乙醇粗提物与没食子酸、大黄素分别配伍明显促进细胞增殖。DNA片段的琼脂糖凝胶电泳、TUNEL法及流式细胞仪结果显示,经药物预处理一定浓度下可拮抗H2O2诱导细胞凋亡。巴豆霜乙醇粗提物与没食子酸抑制细胞凋亡与Caspase-3活化有关;与大黄素配伍能抑制细胞的凋亡,与活化Caspase-3无关。结论:1.清洁级环境条件下,TNBS+50%乙醇浓度为本实验造模的最佳浓度;SPF级环境由于缺乏致病微生物,大鼠损伤后很快修复,不适合本课题的实验研究。2.肠粘膜免疫异常、细胞因子失衡参与UC发病。大黄、巴豆霜通过抑制肠粘膜局部免疫,促进外周炎性因子平衡的恢复,发挥治疗作用。巴豆霜+没食子酸组达到相似治疗效果,提示:没食子酸可能为大黄和巴豆霜配伍发挥止泻作用的有效物质基础。巴豆霜、大黄素亦可改善病理损伤,但免疫调节方面效果不明显。3.巴豆霜乙醇粗提物和没食子酸、大黄素分别配伍可促进细胞增殖,抑制凋亡。综上所述,大黄、巴豆霜通过抑制肠道局部炎症,维持外周细胞因子网络平衡,抑制细胞凋亡,达到止泻、保护肠粘膜,治疗溃疡性结肠炎目的。没食子酸、大黄素、巴豆霜乙醇粗提物可能为其配伍治疗UC的药效物质基础