脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤之一,约占全部脑肿瘤的45-55%。目前,脑胶质瘤的治疗手段主要包括手术治疗、放射治疗、化学治疗和综合治疗等,尽管近年来上述治疗措施已取得长足进步,但由于胶质瘤呈浸润性生长,与周围脑组织无明显分界且易于复发,且疗效均不甚理想。新的治疗手段如基因治疗等虽有望成为治愈胶质瘤的途径之一,但是目前仍缺乏理想可靠的治疗靶标。因此寻找调控胶质瘤细胞恶性生物学行为的分子靶标,明确其在胶质瘤发病过程中的病理机制,已成为神经外科领域的研究热点之一。本研究拟通过观察TPX2在不同病理级别脑胶质瘤以及胶质瘤细胞株中的确切表达情况,并通过研究TPX2在胶质瘤细胞株中的异常表达,研究TPX2在胶质瘤发生发展过程中的功能角色。实验共分为三个部分：第一部分,观察TPX2在脑胶质瘤组织中的表达水平以及与胶质瘤病理级别的相关性,调查TPX2的表达水平与胶质瘤患者生存时间的关系；第二部分,观察TPX2在U251和U87脑胶质瘤细胞株中的mRNA和蛋白表达水平,并调查TPX2蛋白在U87细胞内的亚细胞定位；第三部分,通过RNA干扰的方法抑制TPX2基因在胶质瘤细胞内表达,观察其对U87胶质瘤细胞株生长、增殖、凋亡等细胞生物学进程的影响.以及TPX2对部分周期和肿瘤相关性蛋白的影响。因此,探讨TPX2参与脑胶质瘤发生发展以及恶变的分子病理机制,有助于明确胶质瘤的恶性生物学行为及机理,有望为胶质瘤的临床治疗提供新的分子靶标。一人脑胶质瘤中TPX2的表达和临床病理相关性及生存分析目的：研究TPX2在脑胶质瘤组织中表达水平及其与胶质瘤病理级别的相关性,TPX2表达水平同胶质瘤患者生存时间的关系。方法：采用免疫组化染色检测5例正常脑组织和52例不同级别脑胶质瘤中TPX2的表达情况。临床调查胶质瘤患者,利用生存分析检验TPX2表达水平同患者生存时间的相关性。然后用实时定量RT-PCR和Western blot杂交分别检测组织中TPX2蛋白和mRNA在的表达水平。并分析TPX2表达水平同胶质瘤级别的相关性。结果：采用免疫组化法检测了5例正常脑组织及52例人脑胶质瘤石蜡标本中TPX2蛋白的表达情况。结果显示,正常脑胶质细胞TPX2蛋白染色为阴性,绝大部分胶质瘤标本中可见TPX2蛋白的阳性表达。在大部分其它类型的胶质瘤中也可见TPX2蛋白的阳性表达。脑胶质瘤的临床病理级别与TPX2的表达强度与肿瘤恶性程度呈正相关关系(P<0.01)；而性别和年龄则无统计学上的差异(P>0.05)。生存分析表明,TPX2免疫组化染色表达水平同患者生存时间成负相关(p<0.05)。根据TPX2的cDNA序列设计相应引物,应用RT-PCR检测TPX2 mRNA在52例不同级别脑胶质细胞瘤和5例正常脑组织中的表达显示：TPX2 mRNA表达水平在胶质瘤组织中明显上调,与正常脑组织相比差别显著(P<0.01)。并且,TPX2 mRNA水平在高级别胶质瘤组织中的表达水平明显高于低级别胶质瘤,二者相比差异显著(P<0.01)同样,利用Western blot法测定TPX2蛋白在上述胶质瘤组织的表达,结果显示：TPX2蛋白在胶质细胞瘤组织中表达明显上调,与正常脑组织相比差别显著(P<0.01)。TPX2在Ⅲ-Ⅳ级(高恶度)胶质瘤中高表达,而在Ⅰ-Ⅱ级(低恶度)胶质瘤中表达量较低,Ⅲ-Ⅳ级与Ⅰ-Ⅱ级TPX2蛋白的表达量相比较有显著差异(P<0.001)。结论：TPX2在脑胶质细胞瘤可见阳性表达。其表达水平同脑胶质瘤的级别呈明显相关,同胶质瘤患者的生存时间呈负相关。第二部分TPX2在U87、U252胶质母细胞瘤细胞株中的表达目的：研究TPX2在胶质母细胞瘤(GBM)细胞系U87和U251中的mRNA、蛋白表达水平以及TPX2蛋白在U87细胞内的亚细胞定位情况。方法：应用RT-PCR法检测TPX2在GBM细胞系U87和U251中的mRNA表达水平,应用细胞Western blot法研究TPX2在U87和U251细胞系中的蛋白表达水平。应用免疫荧光染色,共聚焦显微镜系统检测TPX2蛋白在U87细胞内的表达及亚细胞定位情况。结果：RT-PCR结果提示TPX2 mRNA表达水平在胶质瘤细胞系U87和U251中明显上调,与正常脑组织相比差别显著(P<0.05)。Western blot法测定TPX2蛋白在U87和U251细胞系中的表达,结果表明：二者TPX2蛋白水平明显高于正常脑组织。免疫荧光染色显示,TPX2蛋白定位于U87细胞核内,并且同细胞核内纺锤体密切相关。结论：TPX2位于细胞核内,且在GBM细胞中其mRNA和蛋白表达水平明显高于正常脑组织。第三部分TPX2异常表达对U87胶质瘤细胞生长、增殖和凋亡的作用以及对部分细胞周期相关性蛋白的影响目的：研究通过RNA干扰抑制TPX2基因后对U87胶质瘤细胞株生长、增殖、凋亡的作用。方法：利用RNA干扰抑制U87细胞株内TPX2的表达。观察细胞生长,3H-TdR同位素渗透法测定细胞增殖。流式细胞仪及Hoechst 33258染色检测细胞凋亡测定细胞凋亡。RT-PCR和Western blot测定TPX2异常表达的细胞株Aurora A、Ran、p53、Cyclin D1、Cyclin B1、c-Myc等mRNA和蛋白表达水平变化。结果：转染TPX2 siRNA可有效导致U87细胞内的TPX2表达。抑制了TPX2表达的细胞株同未转染组相比,其生长、增殖明显降低(p均<0.01)。经流式细胞仪检测,TPX2 siRNA转染后U87的凋亡率较对照组明显增加(p<0.01)。U87细胞内TPX2表达抑制后,Aurora A和Ran cyclin B1 mRNA表达均较对照明显降低,而p53和c-Myc mRNA表达均明显增加,cyclin D1的mRNA表达无显著变化。同样,在Western blot实验中我们发现上诉蛋白表达同样有类似结果。结论：TPX2可促进GBM细胞的生长、增殖、侵袭,并导致肿瘤细胞凋亡减少。敲除TPX2表达可促进肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭,并促进肿瘤细胞的早期凋亡。同时,抑制TPX2表达可导致细胞周期相关性蛋白Aurora A和Ran的表达明显下调,而肿瘤和凋亡相关性蛋白p53、c-Myc表达明显增加,细胞周期相关性蛋白cyclin B1的表达也明显降低。由此可见,TPX2促进肿瘤生长、增生的作用机制可能是多方面的。抑制TPX2表达可能作为未来胶质瘤靶向治疗的选择之一。