引发艾滋病的人类免疫缺陷病毒（HIV）具有高度的变异性。全球广泛传播的HIV-1分为M群、O群、N群和P群,HIV-1的M群包括9个亚型、72个流行重组毒株（CRFs）和无数独特重组毒株（URFs）。HIV-1不仅基因型高度多样,还有复杂的表型特征。主要包括复制能力和生长动力学、致细胞病变的作用、细胞嗜性、辅助受体使用和Env蛋白的V3环顶端氨基酸序列等。这些生物学表型特征之间有紧密的联系,并与HIV-1的致病性、传播能力、免疫逃逸及疾病进程密切相关。由于可代表体内病毒真实情况的HIV-1临床分离毒株难以获得,相对于基因序列水平的研究,表型研究的难度很大。正因如此,基因型研究获得的大量提示性结果也未能在表型层面得到验证。我国流行的HIV毒株复杂多样,主要流行毒株有B（包括Thai-B）、CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC这4个基因型的毒株,还有大量新型重组毒株。目前,由于对我国HIV-1流行毒株生物学表型的研究缺乏,导致我们不能全面理解我国HIV-1流行毒株的生物学特征、不能科学解释近几年临床上发现的病程速率改变的现象,也极大地影响了疫苗等生物防治方法的研究。CRF07_BC是在我国云南形成的以C亚型毒株为骨架插入B亚型片段的流行重组毒株,最初主要在吸毒人群中流行,近几年也扩散进入性传播人群特别是男男同性传播人群,占全国感染总数的35.5%。大量研究发现这个毒株具有独特的致病特征,例如,感染这个毒株的人初始CD4细胞计数相对较高病程进展可能较慢。然而此毒株的感染性和致病性相关因素目前尚缺乏研究。本研究首先进行了我国HIV-1流行毒株分离培养和全面的生物学表型特征研究,构建了具有充分多样性的毒株样本盘,并对我国常用的病毒载量和p24抗原检测试剂进行了评价。基于我们发现的以CRF07_BC为代表的HIV-1C类病毒特有的Rev101提前终止现象,进行了Rev-RRE对复制和感染影响的研究。以期全面了解我国HIV-1流行毒株的表型特征,为揭示致病机制及生物防治研究奠定基础。第一章我国HIV-1流行毒株的分离鉴定和表型特征研究我国流行HIV-1毒株的基因型和表型的多样性对病毒传播和病程进展有显著影响。目前我国HIV-1多样性研究大多停留在序列和基因型层面,缺乏生物学表型研究,病毒表型多样性与毒力及致病性之间的关系亟待阐明。另外,hiv-1毒株的多样性和复杂性为艾滋病监测和诊断方法的完善,疫苗的研发和临床治疗带来了一系列挑战。目前缺少能代表我国hiv-1多样性的毒株样本盘用于对相关检测和生物防治方法的适用性评价。目的:分离培养我国流行的hiv-1毒株,对其复制能力和表型特征进行全面鉴定;建立一组能代表我国流行hiv-1毒株多样性并可以用于艾滋病检测方法评估的hiv-1样本盘。方法和结果:（1）样本的采集与病毒的分离培养:1)通过我国hiv-1耐药监测项目从10个省市收集48例hiv感染者的新鲜抗凝外周静脉血液样本,分离外周血单核细胞（pbmcs）,与健康供血者的pbmcs共培养,在生物安全3级实验室连续培养28天,期间定时补充细胞并扩大培养,获得我国2010年至2013年间hiv-1临床分离株14株。2)对我实验室2002年至2009年间初步分离的51株病毒进行扩大培养,获得稳定传代的病毒分离株16株。最终共获得30株高浓度（106-109cp/ml）、大量（>40ml）液氮冻存保种的病毒株。分离的病毒包括b（13例）,crf01_ae（12例）和crf07_bc（4例）三种我国广泛流行的毒株和较为罕见的g亚型（1例）毒株;传播途径包括血液传播（13例）、同性性传播（8例）、异性性传播（6例）、静脉吸毒传播（1例）及传播途径不明（2例）。（2）序列测定及基因型鉴定:对病毒基因组进行扩增和测序,得到6条hiv-1全长基因组序列、77条gag/pol区全长或envc2v3区序列（分别为25,27和25条）,经系统进化分析,证实30例样本包括如上所述4个亚型,且crf01_ae毒株分属于3个传播簇。（3）复制动力学研究:p24抗原浓度大于2ng/ml的11株毒株中3株为相对快/高型（r/h）复制毒株,且均有致合胞体形成的能力（si）,其中一株crf01_ae亚型的毒株复制能力极强,是参考毒株nl4-3的217倍。（4）通过envv3区序列预测env相关的表型:1)辅助受体使用:17株为使用ccr5辅助受体的m嗜性毒株,12株为使用cxcr4/ccr5的双嗜性毒株,有1例无法预测。快/高型复制且可致合胞体形成（syncytiainducing,si）的4个毒株都是x4/r5双嗜性,复制快/高但不致合胞体形成（non-syncytiainducing,nsi）的sx2010001只使用ccr5辅助受体;2)v3环顶端四肽包括gpgr,gpgq,gqgr,gpgh和gwgr共5种,复制相对较高的5个毒株的顶端四肽均为gpgr;3)糖基化位点:所有毒株的v3环糖基化位点为8¹3个,其中17、30、36、42、98、131和137位为大部分毒株共有的糖基化位点,复制能力相对较高的5个毒株中有4个在第3位出现了n-糖基化,而其他毒株中均未出现此糖基化位点,提示可能与病毒的感染和复制能力相关。（5）根据pol区序列鉴定耐药突变位点:在得到pol区序列的27个毒株中有16个出现耐药突变位点,其中7个可能会出现中高度耐药,而其中2个未经治疗。（6）以30株hiv-1流行毒株作为样本盘对2种常用检测试剂进行评估:以30株病毒的培养上清液对nuclisenseasyqhiv-1version2.0和cobasampliprep/cobastaqmanhiv-1testversion2.0这2种病毒载量试剂盒进行评价,发现2种试剂盒对b亚型毒株的检测具有良好的一致性,而对crf01_ae毒株检测的一致性相对较差,提示现有的试剂检测crf01_ae毒株的病毒载量还有待改进。另外还评价了2种hiv-1p24抗原检测试剂。结论:获得了高浓度并大量冻存保种且人口学和生物学背景清晰的30株我国hiv-1流行毒株,具有充分的基因型和表型多样性。发现一株复制能力极强的crf01_ae亚型毒株,发现常用的病毒载量试剂检测我国广泛流行的crf01_ae毒株的一致性较差,提示需要针对crf01_ae毒株改善性能。这项研究为揭示我国hiv-1的致病机制及生物防治研究奠定了基础。第二章hiv-1c类病毒rev蛋白第101位密码子提前终止现象及其生物效应研hiv-1的rev是病毒复制过程中的调节蛋白,通常由116个氨基酸组成,主要作用是特异性结合未剪辑及未剪辑完成的mrna上的rev蛋白反应元件（revresponseelement,rre）,帮助病毒mrna完成出核转运并进行后续表达。rre是病毒mrna经过多样化剪辑后,未剪辑或未剪辑完成的mrna的内含子上的一段rna,是rev蛋白结合mrna的靶标。通过rev与rre的相互作用,使得mrna得以转运出核膜完成表达。以往的研究主要针对欧美常见b亚型毒株rev蛋白的第35⁵0位和第73⁸4位氨基酸的两个主要功能域,未见对非b亚型rev蛋白及其c末端结构和功能的研究。在对我国部分地区hiv-1rev基因进行序列比对时,我们发现在绝大多数c亚型和以c为骨架的重组病毒,rev蛋白的第108位氨基酸（hxb2:101位）出现了一个提前终止密码子（prematureterminationcodon,ptc）,这在其它亚型毒株中极少见到。目的:鉴定rev蛋白101位提前终止现象（rev101ptc）是否为hiv-1c类病毒所特有。分析其对rev-rre功能活性、病毒复制能力以及病毒进化和传播的可能影响。方法与结果:（1）比较rev101ptc在hiv各类毒株中出现的频率以确定其是否为c类病毒的特征:从losalamoshivdatabase下载了hiv-1各亚型共3041条可用的rev基因序列,逐条比对校正并翻译,发现rev101ptc在hiv-1c类病毒（c亚型和以c为骨架的重组病毒）中出现频率为93.8%,而在其它亚型中出现的频率为0.9%（p<0.001）,证明rev101提前终止现象为c类病毒所特有。（2）验证rev101ptc对病毒复制能力的影响:1)将b亚型感染性克隆pnl4-3上rev第101位密码子caa（非终止）突变为taa（终止）,转染hek293t细胞并包装出病毒,发现rev101ptc的引入导致b亚型nl4-3毒株的复制能力的大幅下降（约2⁴个log值）。2)以crf07_bc为c类病毒的代表,将其感染性克隆pxjdc6291-13上rev第101位密码子taa（终止）突变为caa（非终止）,将突变前后质粒转染hek293t细胞,发现突变前后病毒的p24抗原（gag-pol编码）表达水平无差异。3)对编码rev蛋白的mrna进行二级结构预测,分析rev101ptc对B和crf07_bc两个毒株revmrna二级结构的影响。发现rev101ptc的引入造成b亚型revmrna的“茎环”易位,显著改变其二级结构;而rev101ptc存在与否对crf07_bcrevmrna的二级结构并无影响,只是“茎状”结构上一个gu配对变为gc配对。4)为了验证rev101ptc的引入是否会影响rev蛋白的表达水平,将2种亚型rev101密码子突变前后的表达质粒等量转染hela细胞,通过westernblot检测rev蛋白表达水平。发现revb>revbmut（101ptc）,而rev07bc（101ptc）≈rev07bcmut,说明rev101ptc对b亚型rev蛋白的表达有影响,而对crf07_bc的rev蛋白的影响不明显。（3）构建gagpol-rre报告基因表达体系并验证rev101ptc和不同基因型的rre对rev-rre复合体功能的影响:构建b和crf07_bc毒株有和没有101ptc的4个rev表达质粒（pcdna3.1（+）-rev-b、pcdna3.1（+）-rev-bmut（101ptc）、pcdna3.1（+）-rev-07bc（101ptc）和pcdna3.1（+）-07bcmut）;构建b和crf07_bc毒株的rre连接gag-pol基因的2个报告基因质粒（pcdna3.1（+）-gagpol-rre_b和pcdna3.1（+）-gagpol-rre₀7bc）。将2个报告基因质粒分别与4个rev表达质粒配对,组成8个反应体系。用不同浓度梯度的rev表达质粒与报告基因质粒共转染,外源rev蛋白就结合报告基因质粒上的rre,帮助与之相连的gag-pol基因完成出核表达,检测培养上清液中gag-pol的表达产物（p24抗原）,绘制p24含量随rev表达质粒浓度变化的曲线,以曲线上升段线性拟合的斜率为指标衡量rev-rre的相对活性。对得到的8组数据分别从rev和rre的角度进行比较分析:1)rev101ptc对rev-rre活性的影响:只有在rev和rre均为b亚型时,rev101ptc才使rev-rre的功能活性显著下降（p=0.0017）,其他组合rev-rre的功能活性均无显著变化;而不论是否有rev101ptc,使用b亚型rre组合的rev-rre功能活性均显著高于使用crf07_bc亚型rre的组合,提示rre的亚型特征对于rev-rre功能活性的影响比rev更大。2)rre亚型特征对于rev-rre活性的影响:只在与crf07_bc的野生型rev（含rev101ptc）结合时,2种rre对rev-rre活性的影响才无显著性差异（p=0.074）。而与不含rev101ptc的rev07bcmut结合时,2种亚型RRE所造成的差异变得具有显著性（P=0.017）。与突变前后的RevB结合时,2种亚型RRE所造成的差异更大（P值分别为0.001和0.006）。（4）探究RRE上亚型特异性位点对Rev-RRE活性的影响:在2种亚型的RRE上选择处于Rev结合位点或影响其二级结构的4组关键位点及突变,分别引入2种亚型的GagPolRRE报告基因,构建8个质粒,将突变前后的RRE分别与相应的Rev结合,检测其对Rev-RRE功能活性的影响。结果显示,对于RRE B,T192A和G262AG264A突变导致Rev B-RRE B的功能活性显著降低（T192A:P=0.0005;G262AG264A:P<0.0001）。对于RRE 07BC,A111G-G120A和A262G-A264G导致Rev07-RRE07活性降低显著影响（P值分别为0.0171和0.0019）,而A192T则使其活性升高（P=0.0024）。提示192位碱基的改变对RRE功能的影响与两个亚型RRE本来的活性趋势一致;262-264位点的碱基在两个亚型间的正反向突变均会造成Rev-RRE活性的显著下降。结论:发现并证实Rev101提前终止密码是HIV-1 C类病毒特有的现象。它在B亚型Rev编码基因中的引入会显著降低B亚型病毒的复制能力,这可能是通过打乱原有mRNA二级结构影响Rev蛋白自身表达量来减少其它病毒蛋白的表达而造成的。但它的存在与否对HIV-1C类病毒的复制并无影响,这可能与其mRNA二级结构并不会因Rev101PTC而受到影响有关。C类病毒Rev蛋白可以兼容B亚型和C亚型的RRE,这可能是C类病毒Rev蛋白编码基因在所有已发现的B/C重组毒株中得以保留的原因,与C类病毒维持适应和传播优势有关。Rev101提前终止密码可能有助于C亚型Rev维持其自身的稳定性或兼容性。两个亚型毒株RRE上第192位使用碱基的差异可能是造成两个亚型Rev-RRE的功能活性差异的原因之一;而两个亚型RRE上第262位和264位核苷酸对于维持Rev-RRE功能活性至关重要。