研究背景与目的随着我国经济条件的提高,糖尿病呈现出爆发的趋势。根据上海瑞金医院宁光教授的流行病学调查,中国18岁以上成人的2型糖尿病患病率达到了 11.6%。根据国际糖尿病联盟发布的数据,目前拥有糖尿病患者最多的国家是中国。目前我国的国情决定了糖尿病的控制水平的较差,加上现在居高不下的发病率,使得慢性并发症发病率很高,带来了严重的经济和社会问题。我国每年为糖尿病的花费巨大,与其直接相关的花费大约有1734亿人民币,这个数目相当于年医疗总支出的13%左右。糖尿病的慢性并发症以神经病变、视网膜病变、肾病、大血管病变等为主,给患者带来经济负担的同时还给患者造成了生活质量的下降,并且可能出现致残,由此带来一系列的社会问题。糖尿病的并发症都会给人生活带来不方便,其中血管并发症的影响非常重要。中国疾防中心糖尿病慢性并发症调查组调查了在三级甲等医院中住院的2型糖尿病患者,发现血管并发症患病率分别为:心脏血管病17.1%、高血压病34.2%、脑血管病12.6%、下肢血管病5.2%。血管并发症的机制很多,是研究的热点。过多的葡萄糖可以通过内皮细胞膜上的葡萄糖转运体-1进入细胞,细胞在葡萄糖浓度过高的情况下会产生过量的丙酮酸,经过三羧酸循环产生过多的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)提供给呼吸链,从而产生过氧化物,造成内皮损伤。高血糖还可以通过糖基化终末产物增加、蛋白激酶C过度激活等通路造成血管内皮的损伤。最近的研究发现高血糖还可以通过影响内源性H2S的产生引起血管病变。H2S是被认为继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后在体内起重要作用的第三种气体信号分子。H2S是一种低浓度时有臭鸡蛋气味的气体,分子量为34.076,标准状况下无色,易燃,相对密度为(空气=1) 1.19。外源性的较高浓度的H2S对人体来说是一种有毒气体,所以以往对于H2S的研究都是关于其毒理机制的研究。上个世纪90年代以来,发现人体内自己会产生H2S气体,并且在体内作用广泛。体内H2S的产生和含硫氨基酸代谢的有关。产生硫化氢的主要三个酶是胱硫醚-γ -裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)、3-疏基丙酮酸转硫酶(3-mercaptopyruvate sulfur transferase,3MST)和胱硫醚-β -合成酶(cystathionine-β -synthase,CBS)。在体内的H2S主要以NaHS和物理溶解的H2S气体两种方式存在。气体形式占总量的1/3, NaHS约占体内H2S总量的2/3。生理状态下H2S的作用很多。内源性H2S通过增强门冬氨酸受体的活性易化了海马长时程增强作用。星形胶质细胞是形成和调节突触的细胞,H2S还可以引起星形胶质细胞Ca2+内流。通过既调节神经元又调节胶质细胞,H2S可以调控神经突触的活性。在异常情况下如高血糖状态,H2S在心血管组织作用的变化成了血管病变的机制之一。我们前期的研究发现在人脐静脉内皮细胞中高血糖上调过氧化物酶的活性引起活性氧水平的上升,上调Bcl-2相关X蛋白异源异构体(Bax/Bcl-2)的比例,激活半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3),而提前加入外源性的硫氢化钠可以预防这些变化。但是我们前期的研究发现在高血糖时内皮细胞的H2S的合成是减少的,因此H2S的血管保护作用就要减弱。那么为什么在高血糖的环境下,H2S的合成就会减少呢,或者说,减少的机制是什么?我现在进行的研究就是来进行这一方面的探讨。研究方法1.细胞培养:我选取健康足月分娩的在济南市第五人民医院或者山东大学附属山东省立医院孕妇脐带,分离出静脉内皮细胞作为实验对象。本实验已经通过山东大学伦理委员会的讨论同意。试验前告知产妇并签署知情同意书。在脐静脉中灌入0.125%胰酶+0.1%EDTA混合溶液,10分钟后内皮细胞就会脱落下来。培养细胞用加入青链霉素双抗、重组牛成纤维细胞生长因子、胎牛血清的M199培养液。2.细胞处理:采用50%右旋葡萄糖为细胞提供高葡萄糖环境,需要加入培养基的量由我设计的公式算出。抑制磷酸化的p38MAPK作用的抑制剂选用SB203580。3.实时荧光定量PCR①将用于试验的细胞拿出孵箱,用冷的PBS洗皿2-3次。加入Trizol 1ml,裂解细胞,裂解液放入EP管中。②每个EP管内加入200 μl氯仿,剧烈震荡30秒钟,室温静置15分钟;再次震荡30秒钟,室温静置15分钟。③预冷低温离心机,使离心温度能维持在4℃。离心后EP管内液体分为三层。上层的水相含有RNA;中间一层白色沉淀含有蛋白和DNA;下层除了含有蛋白和RNA还有红色苯酚和氯仿。④小心吸取上层水相至另一新EP管,加入等体积的异丙醇颠倒混匀,室温静置5-10分钟。⑤静止后再次放入4℃离心机离心10分钟,管底可以见到白色沉淀,即为RNA沉淀。⑥倒弃上清。用DEPC水配制的75%乙醇洗涤剩余RNA沉淀,洗涤时同样注意避免将RNA洗出试管外。⑦再次离心、洗涤2次,吸去大部分上清液,室温下在通风橱内放置5-10分钟。不能彻底干燥,至沉淀变为湿润的半透明白色为止,干燥过度会使溶解度降低,降低OD260/280的比值。⑧使用DEPC水逐步小量稀释,至沉淀完全溶解。取2 μl用于测定RNA浓度,以OD260/280的比值确定RNA的纯度,所用样品的比值均要求在1.8-2.2之间,否则弃用。⑨将提取的mRNA加入gDNA Eraser进行去基因组反应,然后配制反转录体系,将mRNA反转录成cDNA。⑩将各组的cDNA和SybrGreen配成混合物,将设计好的引物和去离子水配成混合物,然后进行荧光实时定量PCR反应。反应结束后记录好各个样品的cp值,比较各组2-ΔΔcp的差异。4. Western Blot检测蛋白质的表达①准备好冰盒,取经过处理好的细胞放置冰上操作。吸去培养基,加入冷的PBS清洗3遍。每个直径60mm的培养皿加入80-100 μ l蛋白提取液。②用细胞刮子将细胞刮进蛋白提取液,然后转移至EP管冰上裂解30分钟。③冰上裂解完后再使用超声裂解细胞。超声探头不能碰触EP管壁及底部,探头在进入EP管前要剂用酒精和纯水清洗干净,以避免产生其他蛋白污染。④超声裂解后放入4摄氏度低温离心机,离心后取上清液。⑤稀释提取的细胞蛋白浓度,配置AB液,通过BCA法测定蛋白浓度。计算上样量。打开水浴锅,将需要上样的蛋白变性。⑥配制电泳缓冲液,配制好胶,把已经灌好胶的胶板放入电泳槽,进行预电泳。电泳槽中间的缓冲液一定要没过薄板,否则会出现导电不良。然后垂直向上拔出梳子,避免破坏加样孔。上样:先在一个梳子孔中注入蛋白marker2-5μl,然后将蛋白质样品根据计算好的上样量注入各个梳子孔中。⑦电泳:先跑第一阶段,条件是30伏特,60分钟。这样可以把蛋白样品在上层胶里面压成一条线。第二阶段电压是100伏特,根据不同的分子量选择不同的时间。⑧转膜:在托盘中倒入适量的转膜缓冲液,要使倒入的液体能够没过夹子和纤维布。我的内参选取的是 GAPDH (glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenas,甘油醛-3-磷酸脱氢酶),根据目的蛋白和内参蛋白的分子大小进行胶的切割。对于内参GAPDH和CSE选择恒压100伏特,40分钟。MAPK-14和磷酸化的MAPK-14,转膜条件相同。对于分子量较大的Sp1和磷酸化的Sp1转膜条件是100伏特,70分钟。⑨孵育一抗和二抗。⑩显影。5.染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation)①活细胞的交联和裂解:取出培养皿(培养皿使用直径15cm的大皿,加入20ml的培养液)加入550 μl甲醛(37%)溶液,轻摇混匀,室温下静置10分钟。清洗后,加入2ml含有Cocktail Ⅱ的PBS,用细胞刮刀将细胞刮到1个Ep管内,加入裂解液,然后进行超声剪切DNA。②蛋白-DNA免疫共沉淀:准备三个Ep管,每个管内加入100 μl剪切好的DNA-蛋白质悬液,加入900 μ l的dilution buffer,加入Sp1的抗体,经过多次离心、洗涤之后留取沉淀物,即为蛋白-DNA共沉淀物。③蛋白/DNA复合物的洗脱:input管加200 μ l配制好的洗脱缓冲液,然后在室温下放置等待后面的步骤使用。其余3管每个加入100μl,室温孵育15分钟,重新离心,去除离心的沉淀物;然后取上清液再次每管加入100 μl缓冲液重复上一步骤洗涤,最后得到200 μl液体。④游离DNA:对所有的样本,依次加入5mol/LNaC18μl,1μlRNase,4μl 0.5mol/L EDTA 溶液,8 μ llmol/L 的 Tris-HCl 和 1 μ l proteinase K,并经过适当孵育。⑤使用吸附柱纯化DNA:拿出4个吸附柱和4个收集管。将上一步中孵育好的4个Ep管加入结合剂,通过多次离心过滤得到的滤出液就是需要获得的DNA。⑥PCR:将获得的DNA进行PCR扩增。扩增出来的条带进行分析。结果1.在高血糖环境下内皮细胞表达CSE蛋白无论在11.1、16.7或是25mmol/L的葡萄糖浓度下,48小时后我们就观察到CSE的蛋白合成量下降,与正常葡萄糖组相比,各个高葡萄糖浓度组的CSE表达均下降(P<0.05)。2. RT-PCR的结果显示,在不同的葡萄糖浓度下,CSE的mRNA水平是不同的。高葡萄糖浓度处理48小时后,11.1、16.7或是25mmol/L的葡萄糖浓度组CSE的mRNA水平有了不同程度的下降,与正常葡萄糖浓度组相比差别均有显著性(P<0.05)。这提示CSE合成的下降是在转录水平开始的。3. CHIP试验结果显示input组显示阳性,实验组是加入Sp1抗体的组,也是阳性,AC组和NC组结果分别是阳性和阴性。这样的结果说明Sp1结合在CSE基因的起始转录点附近。4.对人脐静脉内皮细胞在正常血糖和高血糖状态下进行western blot检测发现在高血糖状态下Sp1的总量没有增加而是磷酸化水平增加,p38MAPK的磷酸化水平也在增加(P均小于0.05)。给予SB203580阻断磷酸化的p38MAPK的功能后,Sp1磷酸化和CSE的变化消失。结论1.在葡萄糖浓度升高的环境下,CSE的表达是下降的,并且这种下降在转录水平上就发生了。2.在人脐静脉内皮细胞中,Sp1是CSE基因上游参与表达调控的反式作用因子。3.调控CSE表达时是Sp1的磷酸化增加而并非本身数量变化,在调控过程中与p38 MAPK的活性有关。