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目的microRNA是一类进化上高度保守,长度约为22nt的单链小分子非编码RNA,参与转录后水平的基因调控。脂肪细胞和成骨细胞的分化存在着相互制约的关系。有研究表明microRNA在间充质干细胞向脂肪细胞及成骨细胞分化过程中起到重要的调控作用。本研究以miR-20a-5p为对象探讨其对于脂肪细胞分化的作用及作用机制,并探讨在体内抑制miR-20a-5p的表达后对于小鼠肥胖的影响。方法1.分离并培养小鼠骨髓间充质干细胞,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-20a-5p在诱导成脂分化过程中的差异表达,并检测了miR-20a-5p在骨髓基质细胞系ST2诱导成脂分化过程中的表达变化;分析ob/ob肥胖小鼠及正常C57BL/6J小鼠脂肪细胞中miR-20a-5p的表达差异。在骨髓基质细胞系ST2及间充质干细胞系C3H10T1/2中提高或降低miR-20a-5p的水平,利用q RT-PCR、western blotting和Oil Red O Staining等技术观察miR-20a-5p对ST2和C3H10T1/2细胞成脂分化的影响。2.利用靶基因预测软件及荧光素酶报告基因技术鉴定miR-20a-5p的靶基因,并通过基因功能缺失性和获得性研究探索靶基因调节细胞分化的作用机制。3.采用高脂饮食喂养小鼠8周诱导肥胖模型,同时尾静脉注射构建好的miR-20a-5p sponge慢病毒,在饲养过程中记录小鼠体重。饲养结束后,称取各组小鼠体重和脂肪重量,取血清检测血糖、血脂等相关生化指标,采用苏木精-伊红(HE)染色方法对各组小鼠的脂肪组织进行石蜡切片染色,q RT-PCR检测各组小鼠脂肪组织脂肪分化及合成关键因子的表达量。结果1.miR-20a-5p在小鼠骨髓间充质干细胞及ST2细胞诱导成脂分化的过程中表达上升,并且在ob/ob肥胖小鼠脂肪组织中的表达水平显著高于正常C57BL/6小鼠。在ST2细胞、C3H10T1/2细胞和小鼠骨髓间充质干细胞中增强miR-20a-5p表达后,细胞成脂分化加强,脂肪细胞分化关键转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、CCATT增强结合蛋白α(CCATT enhancer binding protein alpha,C/EBPα)、CCATT增强结合蛋白β(CCATT enhancer binding protein beta,C/EBPβ)和表征因子脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty acid-binding protein,a P2)等表达显著升高。相反,抑制内源性miR-20a-5p表达则可抑制ST2等细胞分化为成熟脂肪细胞。2.通过生物信息学在线分析工具预测了miR-20a-5p的候选靶基因为TGF-βII型受体(transforming growth factor-βreceptor II,Tgfbr2)、赖氨酸特异性脱甲基酶酶6B(lysine-specific demethylase 6B,Kdm6b)、Wwtr1(WW domain containing transcription regulator 1)、骨硬化相关跨膜蛋白(osteopetrosis associated transmembrane protein 1,Ostm1)和核转录因子-C(nuclear factor I-C,Nfic),成功构建了包含miR-20a-5p应答序列的Tgfbr2、Kdm6b、Wwtr1、Ostm1和Nfic3’UTR的重组报告载体,荧光素酶报告基因测定证实了miR-20a-5p能够结合Tgfbr2、Kdm6b和Nfic 3’UTR而阻断其表达。靶基因功能研究发现,过表达Kdm6b能够抑制ST2细胞成脂分化,抑制Kdm6b则会显著促进ST2细胞成脂分化。NFIC能够通过转录调控Lrp5表达而激活Wnt/β-catenin信号通路,从而抑制成脂分化而促进成骨分化。此外,研究证实NFIC能够与miR-20a-5p promoter结合,抑制miR-20a-5p的表达,提示miR-20a-5p与NFIC之间存在调节环路,协同调控间充质干细胞的成脂分化。3.高脂饮食诱导8周后成功构建肥胖小鼠模型,具体表现为高脂饮食组体重增加、Lee’s指数变大、脂肪重量增加、脂肪细胞体积变大、糖脂代谢紊乱及胰岛素抵抗。而尾静脉注射miR-20a-5p sponge慢病毒后能够有效抑制高脂饮食鼠肥胖的发生,同时降低血糖、甘油三酯、游离脂肪酸等糖脂代谢生化指标,提高机体对于胰岛素的敏感性。q RT-PCR检测尾静脉注射miR-20a-5p sponge慢病毒后能有效抑制脂肪分化及合成关键因子的表达。结论1.miR-20a-5p与肥胖密切相关,表现为在肥胖小鼠脂肪组织及分化成熟的脂肪细胞中高表达。miR-20a-5p可以促进骨髓间充质干细胞、ST2和C3H10T1/2的成脂分化。2.Tgfbr2、Kdm6b和Nfic为miR-20a-5p的靶基因,且均为脂肪细胞分化的负性调控因子,miR-20a-5p能够靶向抑制Tgfbr2、Kdm6b和Nfic的表达。3.Kdm6b能够抑制ST2细胞成脂分化。NFIC能够通过转录调控调控Lrp5表达而激活Wnt/β-catenin信号通路,从而抑制成脂分化而促进成骨分化。4.NFIC能够与miR-20a-5p启动子结合,抑制miR-20a-5p的转录,miR-20a-5p与NFIC形成了负调控环路,共同调节间充质干细胞的定向分化。5.在小鼠体内,抑制miR-20a-5p的表达能够抑制肥胖发生。