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目的:胃肠道肿瘤是严重威胁人类健康的疾病,其中结直肠癌是当前最常见的恶性肿瘤之一。结直肠癌的发生发展是一个由遗传和环境因素共同参与的多方面、多步骤的发展过程,涉及多种基因突变的积累,揭示结直肠癌的分子发生机制已成为医学界研究的热点。微卫星不稳定(microsatellite instability, MSI)是指在复制过程中由于错配修复基因突变而引起的DNA基因组中简单重复序列的增加或丢失,也称为复制错误阳性或复制错误表型。目前人类的错配修复酶(mismatch repair enzyme, MMR)系统含有9个基因:hMLH1, hMLH3, hPMS1, hPMS2, hMSH2, hMSH3, hMSH4, hMSH5, hMSH6.其中hMLH1(human mut-l homologue1, hMLH1)和hMSH2(human mut-s homologue 2, hMSH2)是人类错配修复系统中功能最重要的两个基因,主要作用是保持遗传物质的完整性和稳定性,保证DNA复制的忠实性。如果这些错配修复基因功能发生缺陷或活性降低,复制过程中出现的错误不能及时被纠正,就会导致MSI的出现,使整个基因组不稳定,随机突变率增高,从而引起肿瘤的发生。PTEN基因是1997年由3个研究组分别发现和命名的一种抑癌基因。PTEN基因又名MMAC1和TEP1。PTEN——phosphatase and tensin homolog deleted onchromosome 10, MMAC1——mutated in multide advance cancers, TEP1----TGFβ-regulated and epithelial cell enriched phosphatase是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因。目前对PTEN的作用机理已有较多报道:(1)可直接使粘着斑激酶(focal adhesin kinase, FAK)去磷酸化,从而抑制细胞生长。( 2 )能抑制三磷酸脂酸肌醇激酶(triphosphatidylinositolphosphate kinase, PIK)的磷酸化作用,阻止二磷酸肌醇酯(phosphatidylinosital biphosphate, PIP2)向三磷酸肌醇酯(phosphatidylinosital triphosphate, PIP3)转化进而阻断蛋白激酶(albumen kinase, Akt)及其下游基因的活性,起到抑癌作用。(3)抑制细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)激活的MAPK(mitogen-activated protein kinase)途径,使其不受整合素和生长因子的影响,从而对细胞增殖起抑制作用。当PTEN表达缺失时,使MAPK途径激活,刺激细胞增殖导致肿瘤形成。本实验采用SP免疫组织化学两步法对42例散发性结直肠癌、相应近端癌旁组织(距癌组织3cm)和远端癌旁组织(距癌组织>10cm)及15例正常结直肠组织进行hMSH2与PTEN蛋白表达的检测。采用Western blot检测42例散发性结直肠癌、相应远端对照组织(距癌组织>10cm)进行hMSH2与PTEN蛋白表达的检测。进一步探讨散发性结直肠癌发病机制及hMSH2与PTEN蛋白表达表达与临床病理之间的关系。方法:1材料与方法1. 1材料研究对象为在2006年1月至2006年10月期间在河北医科大学第二医院外科接受治疗的42例原发性结直肠癌的患者,取患者癌组织、相应近端癌旁组织(距癌组织3cm)和远端癌旁组织(距癌组织>10cm)及15例正常结直肠组织(为外伤、息肉、溃疡病需手术切除的正常结直肠组织)所取标本备2份。1份迅速放入-80℃冰箱中以保持标本的新鲜备用,另1份经10%福尔马林溶液固定、石蜡包埋、4μm连续切片备用。癌组织均经病理医师确诊。1. 2主要试剂hMSH2兔抗人多克隆抗体购自Biolegend公司,工作浓度1:100,PTEN兔抗人多克隆抗体购自Biolegend公司,工作浓度1:50,SP免疫组化试剂盒、DAB试剂盒均购于北京中山生物技术公司。1. 3 SP免疫组织化学两步法对42例散发性结直肠癌、相应近端癌旁组织(距癌组织3cm)和远端癌旁组织(距癌组织>10cm)及15例正常结直肠组织进行hMSH2与PTEN蛋白表达的检测。采用Western blot检测42例散发性结直肠癌、相应远端对照组织(距癌组织>10cm)进行hMSH2与PTEN蛋白表达的检测。2采用SAS6.12统计软件进行统计学数据处理,计数资料用χ2检验,P<0.05为差异有显著性意义。应用非参数统计中Spearman等级相关对二者在结直肠癌中的表达相互间关系进行分析。结果:1用免疫组织化学法检测hMSH2与PTEN蛋白表达1.1 hMSH2和PTEN蛋白在结直肠癌组织及对照组织中的表达hMSH2失表达率(阴性表达率)在癌组织为30.95%(13/42),在近端癌旁组织为19.05%(8/42),在远端癌旁组织为16.67%(7/42),在正常结直肠组织为6.67%(1/15)。hMSH2在癌组织中失表达率高于近端癌旁组织、远端癌旁组织及正常结直肠组织(P<0.05),而近端癌旁组织、远端癌旁组织和正常组织表达无明显差异(P >0.05)。PTEN失表达率在癌组织为42.86%(18/42),在近端癌旁组织为23.81%(10/42),在远端癌旁组织为16.67%(7/42),在正常结直肠组织为6.67%(1/15)。PTEN在癌组织中失表达率高于近端癌旁组织、远端癌旁组织及正常结直肠组织(P <0.05),而近端癌旁组织、远端癌旁组织和正常组织表达缺失率无明显差异(P >0.05)。1. 2结直肠癌患者癌组织中hMSH2和PTEN蛋白表达特征与临床病理类型关系1. 2. 1 hMSH2失表达率与患者的年龄、性别、肿瘤发生的部位、肿瘤分化程度、侵透浆膜、Dukes分期、淋巴结转移、组织学类型、大体类型均无明显关系(P >0.05)。1. 2. 2 PTEN失表达率与肿瘤分化程度呈负相关(rs=-0.727,P <0.05),分化程度越高,PTEN失表达率越低。与侵犯深度(侵透浆膜)、Dukes分期、淋巴结转移呈正相关(相关系数分别为rs=0.727、rs=0.718、rs=0.718,P <0.05)。侵润程度越深、肿瘤分期晚期、有淋巴结转移,PTEN失表达率越高。PTEN表达与患者的年龄、性别、肿瘤发生的部位、组织学类型、大体类型均无明显关系(P >0.05)。2 Western Blot检测结果42例结直肠癌组织与远端对照组织(距癌组织>10cm)相比中hMSH2蛋白有25例出现低表达,其低表达率为59.52%,PTEN有19例出现低表达,其低表达率为45.24%。3 hMSH2与PTEN蛋白表达在散发性结直肠癌中呈正相关(免疫组化检测中rs=0.679,蛋白印记检测中rs=0.816,P <0.05)。错配修复蛋白hMSH2表达缺失伴有PTEN蛋白表达下调。结论:(1)hMSH2与PTEN在散发性结直肠癌的呈缺失性表达。(2)PTEN蛋白失表达率与肿瘤分化程度呈负相关,与dukes分期、侵润深度、淋巴结转移均呈正相关。(3)hMSH2与PTEN在散发性结直肠癌中的表达呈正相关。(4)在散发性结直肠癌发生、发展过程中错配修复蛋白hMSH2表达缺失伴有PTEN蛋白表达下调导致抑癌基因失活,二者共同参与了散发性结直肠癌的发生、发展,导致了恶性肿瘤的形成。