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乳腺癌是一种女性常见的恶性肿瘤。调查表明,2000-2005年,我国女性乳腺癌的发病与死亡均呈上升趋势,发病人数增长了38.5%,死亡人数增长了37.1%,中国已成为乳腺癌发病率增长最快的国家之一。因此迫切需要建立新的乳腺癌早期诊断和预后判断方法,为其成功治疗奠定基础。随着分子生物学、细胞生物学和生命分析化学的发展,新的肿瘤标志物和新的检测技术在近年来被越来越多地用于乳腺癌研究。本论文对乳腺癌中表观遗传学相关基因的分析方法进行了研究,主要包括三部分,从胞外的DNA甲基化相关基因及甲基化位点的检测,到细胞内的:miRNA的分析。首先对乳腺癌患者血浆游离DNA中UHRF1基因表达的临床意义进行了研究,然后发展了一种超支链滚环扩增比色分析新方法并用于乳腺癌患者血浆游离DNA中p16/CDKN2启动子的甲基化分析,最后应用壳聚糖/多聚谷氨酸复合物转运量子点标记探针实现细胞内miroRNA前体的原位检测。1.乳腺癌患者血浆游离DNA中UHRF1基因的临床意义研究利用荧光定量PCR技术以及蛋白印迹法,检测乳腺癌患者肿瘤组织中的UHRF1基因表达和蛋白含量,并对229名乳腺癌患者血浆游离DNA中的UHRF1基因进行了定量分析,探讨其在临床诊断中的应用价值。结果表明:乳腺癌患者血浆游离DNA中,UHRF1基因含量与对照组比较明显升高,具有较高的敏感度(79.2%)和特异度(76.2%),且与患者的癌症分期、淋巴结转移情况以及c-erbB2阳性状态均有较好的相关性。血浆游离DNA中UHRF1基因含量高的患者,无进展生存期明显变短。因此,UHRFl基因作为新的生物学指标对乳腺癌的诊断和预后分析具有一定价值。2.超支链滚环扩增比色分析新方法用于p16/CDKN2启动子的甲基化分析DNA甲基化是表观遗传调控基因表达的重要方式,在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育过程中起着极其重要的作用。本论文发展了一种基于超支链滚环扩增的比色法分析,并应用于p16/CDKN2基因启动子区域的甲基化研究。使用DNA捕做探针修饰的96孔板,通过四步法实现对DNA的甲基化进行检查:DNA识别、甲基化特异酶切、滚环扩增和比色分析。本方法具有很好的特异性,吸光度值与甲基化的DNA浓度的对数在100fM-10nM范围内有很好的线性关系。对72例乳腺癌患者血浆游离DNA中的p16/CDKN2启动子区域的甲基化状态进行了分析,结果表明79.2%(57/72)的患者血浆可检测至p16/CDKN2启动子区域发生了甲基化改变,对照组中只有9.3%(4/43)的正常人血浆中被检测到甲基化的p16/CDKN2启动子,两组统计学差异明显(P<0.0001)。因此这种甲基化比色检测法是一种简单、快速、灵敏的、经济的检测方法,有望用于相关疾病DNA甲基化的临床高通量检测。3.壳聚糖/多聚谷氨酸复合物转运量子点标记探针实现细胞内miroRNA前体的原位检测本章利用壳聚糖(CS)-聚谷氨酸(γ-PGA)纳米材料作为有效的基因载体,转运量子点标记的探针,进行细胞内microRNA前体的原位检测(pre-miRN A)。包裹在纳米材料载体中的RNA探针,进入细胞释放后可识别目标pre-miRNA,在目标pre-miRNA加工的过程中,探针被切断并释放出量子点的荧光信号,量子点荧光信号的强度与细胞内pre-miRNA的数量成正比。因此,本方法可以对细胞内目标pre-miRNA进行高灵敏的定量检测。以乳腺癌细胞株MDA-MB231和MCF-7为研究对象,对细胞内let-7a的pre-miRNA含量进行分析。实验发现纳米材料载体可有效的转运探针进入细胞对目标分子进行检测。对比荧光定量PCR的检测,结果显示本方法具有较好的灵敏性和特异性,在肿瘤的诊断和预后检测中具有广阔的发展潜力。