论文部分内容阅读
Micro RNAs(mi RNAs)是一类约为22个核苷酸的内源性非编码单链RNA。在细胞核中RNA聚合酶Ⅱ以基因组DNA为模板转录形成初始mi RNAs(primi RNAs),经核糖核酸酶Drosha切割形成长度约70个核苷酸的具有茎环结构的前体mi RNAs(pre-mi RNAs),前体mi RNAs通过Exportion5/Ran-GTP转运出核,在细胞质中被核糖核酸酶Dicer切割并形成mi RNA诱导沉默复合物(mi RISC)。通过与靶基因m RNA的3’非翻译区(3’UTR)结合,降解m RNA或阻遏蛋白翻译。研究表明mi RNAs参与调控细胞生长、发育、代谢及凋亡等许多生理过程,且在多种疾病中表达异常,和疾病的发生发展密切相关。血管是机体不可或缺的物质基础,其主要功能是输送氧气和人体必需物质。血管生成是一个多基因参与的复杂过程,在肿瘤发展中具有重要的作用。研究表明mi RNAs作为转录后调控因子参与了血管生成的调控。Mi R-574基因定位于4号染色体短臂4p14,编码两种成熟的mi RNAs:mi R-574-3p和mi R-574-5p。现有的研究显示mi R-574-3p具有抑癌作用,而mi R-574-5p则具有促癌作用。目前,调控mi R-574表达的分子机制仍不明确,亦无证据表明mi R-574参与了血管生成。在本论文中,我们研究了转化生长因子β1(TGF-β1)和缺氧诱导胃癌细胞中mi R-574表达的分子机制,同时研究了mi R-574对血管生成的作用和分子机制。我们首先研究了TGF-β1对胃癌细胞AGS中mi R-574表达的影响。QRT-PCR结果显示TGF-β1上调了AGS细胞中pri-mi R-574和mi R-574-3p的表达,但对mi R-574-5p的表达没有影响。TGF-βⅠ型受体抑制剂SB431542和沉默Smad4能够阻断TGF-β1诱导的mi R-574-3p表达上调。我们预测了mi R-574基因的启动子序列,发现其位于mi R-574基因上游1kb片段内,且包含四个潜在的Smads结合位点。双荧光素酶报告分析显示,TGF-β1增加了mi R-574基因启动子的转录活性,而沉默Smad4抑制了TGF-β1诱导的转录活性。染色质免疫沉淀(Ch IP)证实,Smad4能够与mi R-574基因启动子直接结合,而Smad3则无此作用。MTT实验证明TGF-β1通过上调mi R-574-3p的表达来发挥其细胞增殖抑制作用,mi R-574-3p抑制剂部分缓解了TGF-β1诱导的AGS细胞增殖抑制。其次,我们发现缺氧能诱导mi R-574表达。在物理缺氧(2%O2)和化学缺氧(Co Cl2)下,胃癌细胞AGS、SGC-7901和宫颈癌细胞Hela以及293T细胞中mi R-574-3p和mi R-574-5p表达都上调。在293T细胞中过表达稳定存在的突变型HIF-1α同样上调了mi R-574-3p和mi R-574-5p的表达。HIF-1α抑制剂2-Me OE2和沉默HIF-1α均能显著抑制缺氧下SGC-7901细胞中mi R-574-3p的表达。对mi R-574基因的启动子序列进行分析,发现其包含四个潜在的缺氧反应元件。双荧光素酶报告分析显示,HIF-1α能激活mi R-574基因启动子的转录活性。Ch IP实验证实,HIF-1α能够与mi R-574基因启动子直接结合。此外,我们构建了mi R-574表达载体p EGFP(C1)-574。过表达mi R-574能稳定AGS细胞中HIF-1α。在稳定表达mi R-574的稳转细胞株SGC/p EGFP(C1)-574中HIF-1α蛋白也增加。向SGC/p EGFP(C1)-574细胞中分别转染mi R-574-3p和mi R-574-5p抑制剂,结果表明mi R-574引起HIF-1α蛋白水平增加与mi R-574-3p相关,而与mi R-574-5p无关。生物信息学预测发现CUL2 m RNA的3’UTR区有mi R-574-3p的结合位点,可能是mi R-574-3p的靶基因。双荧光素酶报告分析证实了这一推测。免疫共沉淀结果显示,过表达mi R-574通过抑制CUL2破坏了E3-泛素连接酶复合体的形成。在SGC/p EGFP(C1)-574细胞中,HIF-1α的蛋白水平增加,但HIF-1β表达无明显变化;免疫荧光结果显示细胞中HIF-1α和HIF-1β主要分布在细胞核中。抑制SGC/p EGFP(C1)-574细胞中HIF-1α的入核,部分降低了mi R-574-3p的表达;且mi R-574-3p引起的HIF-1α蛋白增加能够激活mi R-574基因启动子的转录活性,表明二者间存在正反馈调控环路。最后,我们研究了mi R-574对血管生成的影响。在SGC/p EGFP(C1)-574细胞中VEGF m RNA和蛋白表达显著增加,其培养液能促进HUVEC细胞的增殖、迁移、浸润和小管的形成。抑制SGC/p EGFP(C1)-574细胞中mi R-574-3p的表达,显著减少了HIF-1α和VEGF蛋白表达,抑制了HUVEC细胞增殖、迁移、浸润和小管的形成。抑制SGC/p EGFP(C1)-574细胞中mi R-574-5p的表达,只减少了VEGF的表达,同时抑制了HUVEC细胞增殖、迁移、浸润和小管的形成。另外我们发现mi R-574-5p能激活胃癌细胞中MAPK信号通路。我们揭示了胃癌细胞AGS中TGF-β1/Smad4信号通路调控mi R-574-3p表达的机制,以及缺氧通过HIF-1α上调mi R-574-3p和mi R-574-5p的表达。Mi R-574-3p通过靶向CUL2稳定细胞中HIF-1α水平,而mi R-574-5p通过激活MAPK信号通路增强HIF-1α转录活性,形成一个正反馈调控环路;最后mi R-574能够上调VEGF表达来促进血管生成,分别抑制mi R-574-3p和mi R-574-5p都能引起VEGF表达降低并减少血管生成。本研究对生长和发育中血管的生成、组织创伤愈合、心脑血管阻塞后血管再生,以及肿瘤组织血管生成等生理或病理过程具有重要意义。