目的:本研究目的为构建唾液腺腺样囊性癌（Salivary Adenoid Cystic Carcinoma,SACC）细胞与间质细胞三维（Three-dimensional,3D）共培养以及细胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）在线捕获和检测的微流控系统,在新的技术平台上探究3D环境中间质细胞对肿瘤细胞分泌EVs的影响。方法:本研究所用细胞包括人腺样囊性癌细胞株SACC-83和SACC-LM,以及从人SACC肿瘤组织中提取获得的癌相关成纤维细胞（CarcinomaAssociated Fibroblasts,CAF）。用于表征EVs捕获和检测的细胞条件培养液（Conditioned Medium,CM）为去除EVs的血清培养细胞48小时,收取培养液,经差速离心依次去除细胞碎片、凋亡小体、大囊泡后,留存上清液。实验所使用的微流控芯片是以光刻胶技术制备的SU8为模板,由聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane,PDMS）基片与载玻片不可逆封接而成。首先我们考察了EVs捕获检测芯片的技术可行性,芯片通道表面经处理后固定CD63抗体,接着将差速离心后的CM上清液加入芯片内,根据抗原抗体特异性结合的原理,捕获抗体与EVs膜表面的CD63特异性识别并结合,利用原子力显微镜（Atomic Force Microscope,AFM）扫描芯片,检测芯片表面被捕获的EVs。随后将CM分为4个浓度梯度（原液、1:2、1:4和1:8等比稀释液）,分别加入EVs捕获检测芯片中完成捕获,利用免疫荧光的方法标记检测EVs,同时采用EXOCET standard kits检测相应浓度CM中EVs的含量,进一步验证该芯片捕获EVs的情况。然后我们基于微流控芯片技术构建了灌流3D细胞共培养模型,细胞培养芯片包含5条通道构成,分别命名为C1、C2、C3、C4和C5,通道间由微柱形成的“栅栏”相隔,C1与C5通道为培养液灌流通道、C2与C4为细胞3D培养通道、C3为基质通道。细胞培养芯片通过灌流管与微流量注射泵相连,同时利用四氟管与EVs捕获检测芯片连接,以0.2μL/min的速度连续灌流培养2天或4天,灌流结束后拆除灌流装置,利用Hoechst33342、Rh-123和PI联合染色检测细胞活性和SACC细胞的侵袭情况。最后利用anti-CD63和anti-MMP2抗体在线检测肿瘤细胞分泌的EVs。结果:本研究成功构建了基于微流控芯片的EVs捕获检测平台:AFM扫描图像显示芯片表面90%以上的EVs大小在30～200 nm之间,符合目前公认的外泌体大小范围。利用免疫荧光标记的方法可以检测芯片内被捕获的EVs,其荧光强度与CM中EVs的含量呈正比。基于微流控芯片的细胞3D培养或共培养结果显示经数天的灌流培养,细胞聚集成团生长,均具有良好的活性,镜下观察C3通道,结果发现SACC细胞与CAF细胞共培养时细胞的侵袭面积更大,说明间质细胞能够促进肿瘤细胞发生侵袭。进而,我们将两个芯片连接在一起形成一个集细胞3D共培养和EVs捕获检测于一体的微流控系统,在线研究间质细胞对肿瘤细胞分泌EVs的影响,结果发现SACC细胞在灌流培养条件下,其分泌EVs的量与灌流培养时间呈正相关,并且SACC细胞与CAF细胞共培养时分泌EVs的量显著增加。结论:本研究构建了一个集成肿瘤细胞与间质细胞3D共培养以及EVs在线捕获和检测的微流控系统,基于该系统的研究结果表明间质细胞不仅促进肿瘤细胞侵袭,还可以促进肿瘤细胞分泌EVs。