小麦钾离子转运蛋白TaHAK17和TaHAK4基因的功能验证

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在植物钾转运体家族中,HAK/KUP/KT基因家族成员数目最多,该家族基因能够促进植物生长发育,提高植物对环境的适应性。小麦钾离子转运蛋白Ta HAK17和Ta HAK4位于HAK/KUP/KT基因家族第Ⅳ簇,本实验对Ta HAK17和Ta HAK4的功能进行了验证。主要研究结果如下:(1)利用酵母异源表达系统对Ta HAK17的K+转运功能进行鉴定。以转Ta HAK1基因的酵母突变体菌株CY162作为阳性对照,以转空载体p416的CY162为阴性对照,进行酵母功能互补验证。结果显示,在正常钾离子浓度即K+浓度为100 m M条件下,转Ta HAK17对照菌株与转空载体p416酵母菌株均能正常生长。在K+浓度为1 m M的低钾胁迫条件下,转p416空载体菌株不能正常生长,转Ta HAK17和转Ta HAK1阳性对照菌株均可以正常生长,说明Ta HAK17可以互补酵母突变体的K+转运功能。在正常钾离子浓度即K+浓度为100m M条件下,随着Na+浓度增加,转Ta HAK17、转Ta HAK1与转空载体p416酵母菌株均能正常生长。当K+浓度为1 m M的低钾胁迫条件下,随着Na+浓度增加,转Ta HAK17和转空载体p416酵母菌株不能正常生长,而转Ta HAK1阳性对照菌株可以存活,说明Ta HAK17与Ta HAK1功能不同,Ta HAK17仅具有低亲和K+吸收功能在低钾条件下不具有耐盐性。酵母生长曲线、酵母体内K+含量测定结果显示,在K+浓度为100 m M时,转Ta HAK17酵母菌株与转空载体p416酵母菌株均能正常生长,没有差异。在K+浓度为1 m M时,转p416空载体的酵母菌株不能生长,而转Ta HAK17-p416的酵母菌株能够正常生长,进一步说明了Ta HAK17具有低钾转运功能。(2)低钾胁迫条件下,Ta HAK17能够部分弥补拟南芥athak5单突变体、atakt1/athak5双突变体在低钾条件下的表型缺陷。为了在植物中进一步验证Ta HAK17的低钾转运功能,对转Ta HAK17基因的拟南芥和对照通过非损伤微测技术进行根尖K+流速测定。对哥伦比亚野生型拟南芥生长10 d幼苗进行根尖不同部位K+流速测定,发现根尖分生区的K+向外排出速率最大,其次为根冠,伸长区最小。对转Ta HAK17的拟南芥athak5单突变体、拟南芥atakt1/athak5双突变体和哥伦比亚野生型拟南芥不同株系进行根尖分生区K+流速测定。结果表明,转Ta HAK17的athak5单突变体、atakt1/athak5双突变体拟南芥株系在不同浓度的测试液中K+向外排出的速率均大于非转基因对照,而转Ta HAK17的哥伦比亚野生型株系与对照相比K+外排流速相同。结果表明Ta HAK17基因在植物体内具有促进植物根部K+转运的功能。(3)采用同源克隆的方法克隆Ta HAK4基因,利用酵母异源表达系统对Ta HAK4进行K+转运功能鉴定。通过酵母功能互补验证、酵母生长曲线测定、酵母体内K+含量测定发现Ta HAK4在K+浓度低于1 m M时无法正常生长,在K+浓度高于1 m M能够正常生长,即Ta HAK4在低钾条件下不能促进K+的转运。对Ta HAK4在小麦原生质体内进行亚细胞定位检测,结果显示Ta HAK4表达部位为细胞膜、细胞核和叶绿体。
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