FABP4基因过表达及siRNA干扰对鹅卵泡颗粒细胞激素分泌影响的研究

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:inspisee1999
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脂肪型脂肪酸结合蛋白,又称为脂肪酸结合蛋白4(FABP4)或aP2,是脂肪酸结合蛋白(FABPs)家族中的一员,能结合多种疏水性化合物,在脂肪和卵巢组织中分布广泛,参与脂肪酸的合成代谢,作用于卵巢组织,调控禽类产蛋过程中蛋的脂肪酸营养沉积,从而对禽类产蛋中脂肪酸的沉积起到重要作用,有利于产蛋性能的提高。课题组前期筛选差异表达蛋白时发现,产蛋高峰期豁眼鹅FABP4的表达量升高。鉴于此,本研究选取鹅卵泡颗粒细胞,探讨FABP4对鹅卵泡颗粒细胞生殖激素分泌的影响,为揭示FABP4对禽类产蛋性能的作用及机理奠定理论基础。本研究首先构建FABP4基因的真核表达载体。通过采集豁眼鹅卵巢组织提取组织总RNA,逆转录,PCR扩增后得到FABP4基因的目的片段,连接转化后构建克隆载体pMD18T-FABP4,双酶切后将FABP4基因片段连接到真核表达载体pcDNA3.1上,构建pcDNA3.1-FABP4过表达载体;然后,分离培养原代豁眼鹅卵泡颗粒细胞,利用该细胞进行FABP4基因的干扰和过表达转染试验,分成空白,阴性对照,FABP4-siRNA干扰,pcDNA3.1-FABP4过表达这四个试验组,采集转染后的各组细胞上清液用酶联免疫吸附试验法验证FABP4对雌二醇(E2)和孕酮(P4)的影响,并在mRNA和蛋白表达水平上探讨FABP4对鹅卵巢激素合成和分泌相关基因CYP11A1和CYP19A1的影响,从而探讨FABP4对豁眼鹅产蛋性能影响的分子基础。试验结果为:(1)成功构建真核表达载体pcDNA3.1-FABP4;(2)成功分离出豁眼鹅卵泡颗粒细胞并进行体外培养;(3)成功转染FABP4-siRNA干扰引物和pcDNA3.1-FABP4过表达载体进入豁眼鹅卵泡颗粒细胞中;(4)所采集的细胞上清液中E2和P4含量检测发现,RNA干扰组显著低于空白组和阴性对照组(P<0.05),过表达组显著高于空白组和阴性对照组(P<0.05);(5)检测CYP11A1和CYP19A1 mRNA和蛋白水平的表达量发现,RNA干扰组均显著低于对照组(P<0.05),过表达组均显著高于对照组(P<0.05)。本研究结果表明,FABP4可通过干预CYP11A1和CYP19A1的表达,影响体外培养的鹅卵泡颗粒细胞E2和P4的分泌。
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