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背景Notch受体信号通路具有调控细胞分化、存活、增殖的作用,参与了肺脏的发生、发育,也参与了非小细胞肺癌的发生、发展。人类的Notch受体共有4个,即Notch1～4,均为单次跨膜受体。成熟的Notch受体由细胞外亚基(NEC)和跨膜亚基(NTM)组成,其中NTM包含一截短的膜内结构域和一个较大的胞内结构域(ICD)。当Notch受体信号通路被激活时,ICD从NTM上被酶切下来,并易位入核,启动靶基因Hes与Hey的转录,从而调控细胞分化、增殖或凋亡。肺鳞癌中4个Notch受体的表达情况目前还不完全清楚；Notch受体信号通路对肺鳞癌细胞凋亡的影响及相关分子机制也尚不明了；而且,Notch受体及Notch受体信号通路在肺鳞癌中受何种机制调控也尚不明确。目的1.分析Notch1～4蛋白在肺鳞癌中的表达及其临床病理意义。2.探讨Notch受体信号通路对肺鳞癌细胞凋亡的影响及其分子机制。3.探究肺鳞癌中Notch受体的表达及Notch受体信号通路的激活是否受YB-1基因的调控,并进一步研究Notch受体信号通路是否介导YB-1的凋亡抑制作用。方法1.免疫组织化学SP法检测64例肺鳞癌及癌旁非肿瘤肺组织中Notch1～4蛋白的表达。Spearman等级相关检验分析肺鳞癌中Notch1～4的表达与肿瘤的大小、淋巴结转移、临床分期的相关性。2.γ分泌酶抑制剂DAPT抑制肺鳞癌细胞株SK-MES-1细胞中Notch受体信号通路的活化,Annexin V-PI双染法检测细胞凋亡；Western blot检测PARP蛋白的剪切情况；Western blot及qRT-PCR检测XIAP、Survivin的表达水平；分离胞浆蛋白、线粒体蛋白、胞核蛋白,Western blot分别检测Smac蛋白,Endo G蛋白和AIF蛋白在胞浆、线粒体的含量以及EndoG蛋白和AIF蛋白在胞核中的含量；细胞免疫荧光检测Endo G口AIF蛋白的亚细胞定位。3.构建4个YB-1短发夹RNA(shRNA)干扰质粒pYr-1.1YB-1.shRNA,将其瞬时转染293细胞,RT-PCR检测YB-1mRNA,筛选出干扰效率最高的质粒。针对干扰效率最高的靶序列,应用点突变PCR在YB-1基因的表达质粒pYr-ads-1-YB-1上构建包含靶序列沉默点突变的质粒pYr-ads-1-YB-1M。将干扰效率最高的质粒pYr-1.1-YB-1-shRNA稳定转染SK-MES-1细胞,western blot检测YB-1蛋白的表达及PARP蛋白的剪切。将pYr-ads-1-YB-1或pYr-ads-1-YB-1M分别与pYr-1.1-YB-1-shRNA瞬时共转染SK-MES-1细胞,western blot检测YB-1的表达及PARP蛋白的剪切。4.一方面,在稳定转染pYr-1.1-YB-1-shRNA的SK-MES-1细胞中,应用RT-PCR及Western blot检测Notch1～4受体的表达及活化,RT-PCR检测Notch受体信号通路靶基因Hes1、Hey1的表达；另一方面,将YB-1基因的表达质粒pYr-ads-1-YB-1瞬时转染SK-MES-1细胞,Western blot检测YB-1蛋白的表达及Notch1-4受体的表达和活化,RT-PCR检测Hes1、Hey1的表达；最后,在瞬时转染pYr-ads-1-YB-1的SK-MES一1细胞中,应用DAPT抑制Notch受体信号通路,通过Annexin V-PI双染法检测凋亡,以验证YB-1是否通过激活Notch受体信号通路来抑制顺铂诱导的凋亡结果1.肺鳞癌组织Notch1～4蛋白的表达较癌旁支气管黏膜显著增强(P<0.05),其中Notch1、3的表达与肿瘤的大小呈正相关(r=0.334、0.421,P<0.05),Notch1.2的表达与淋巴结转移呈正相关(r=0.356、0.417,P<0.05)；4个Notch受体的表达与肺鳞癌的临床分期均无明显相关性(P<0.05)。2.Y分泌酶抑制剂DAPT可有效抑制SK-MES-1细胞中Notch受体信号通路的活化,并显著诱导细胞凋亡；不同浓度的DAPT作用SK-MES-1细胞能在翻译水平降低XIAP及Survivin的表达,诱导Smac蛋白从线粒体释放入胞浆,同时促进Endo G和AIF蛋白从线粒体释放入胞浆及胞核。3.4个pYr-1.1-YB-1-shRNA质粒中,2个干扰效率在60%以上,最高抑制率为70.3%；pYr-1.1-YB-1-shRNA质粒稳定转染SK-MES-1细胞能有效抑制YB-1蛋白的表达,并促进PARP蛋白的剪切；pYr-ads-1-YB-1M能回复pYr-1.1-YB-1-shRNA质粒转染所致的YB-1蛋白表达抑制及RARP蛋白剪切。4.YB-1可在转录和翻译两个水平调控Notch1的表达,并促进Notch1受体的活化及Hes1基因的转录,Notch2和Notch3表达及活化不受YB-1的调控,Notch4未能在各组SK-MES-1细胞中检测到。YB-1过表达可显著抑制顺铂诱导的凋亡,但Notch受体信号通路被DAPT抑制后,YB-1的凋亡抑制作用被解除。结论1. Notch受体在肺鳞癌组织中的表达显著上调,可能导致Notch受体信号通路异常激活。2.抑制Notch受体信号通路可通过caspase依赖及非caspase依赖的通路诱导肺鳞癌细胞凋亡。3. pYr-1.1-YB-1-shRNA转染SK-MES-1细胞可诱导细胞凋亡,凋亡效应是由于YB-1的表达被抑制而引起的,而非脱靶沉默效应所致。4. YB-1可调控Notch1受体的表达、活化及Notch受体信号通路,并通过Notch受体信号通路抑制肺鳞癌细胞凋亡。