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背景:增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是一种严重的致盲性眼科并发症,常继发于孔源性视网膜脱离和眼球穿通伤等。同时,PVR也是视网膜脱离手术失败的最常见原因。其中,视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞发生的上皮—间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是PVR发生发展的关键机制。在此过程中,RPE细胞的极性和细胞间连接消失,逐渐转变为成纤维样细胞并表达细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白,参与视网膜表面纤维膜组织的形成。由于EMT潜在的分子机制尚不清楚,临床上对于PVR缺少有效的预防和治疗手段。因此,探讨并阐明RPE细胞在EMT过程中的关键分子机制和调控因素,具有重要的意义。自噬(autophagy)是一种高度保守的,经溶酶体途径降解细胞内大分子和受损细胞器的过程,对于维持RPE细胞内环境的稳定具有重要作用。同时,自噬水平的异常变化与RPE细胞多种病理性改变有关。近年来,在多个组织和器官的纤维化过程中均观察到自噬水平的变化,其在EMT中的调控作用也逐渐受到关注。然而,在RPE细胞中,自噬与EMT的关系及其调控机制尚不清楚。角蛋白(keratin,KRT)8是上皮细胞中含量最多的中间丝蛋白,也是成熟RPE细胞的标志物。最近研究发现,KRT8不仅具有维持细胞形态等骨架蛋白的功能,而且通过多种翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs)方式,特别是磷酸化修饰,参与细胞生长、细胞迁移和细胞应激等多种细胞活动。目前,尚无KRT8及其磷酸化对于RPE细胞EMT过程影响的研究报道,其与自噬之间的相互作用机制也有待进一步研究。本研究旨在探究自噬与KRT8磷酸化在RPE细胞EMT过程中的调控作用,以及两者间可能存在的相互作用关系,为完善PVR的发病机制,以及临床预防和治疗PVR奠定基础。方法:1、利用10ng/ml TGF-β2处理人视网膜色素上皮细胞株(ARPE-19),相差显微镜观察细胞形态变化,western-blot检测EMT标志性蛋白α-SMA、fibronectin和collagenⅣ的表达水平。在此模型基础上,westem-blot检测自噬标志性蛋白LC3-II、Atg5-12、Beclin 1和p62的表达水平,共聚焦显微镜观察GFP-LC3和mRFP-GFP-LC3的荧光水平。同时,利用自噬抑制剂Baf-A1预处理ARPE-19细胞,TGF-β2刺激后western-blot检测LC3-Ⅱ表达水平的变化。此外,在TGF-β2刺激前加入自噬抑制剂(3-MA和Baf-A1)或转染特异性siRNA(si-ATG5和si-BECN1)对ARPE-19细胞预处理,细胞划痕实验和western-blot分别检测细胞迁移能力和EMT标志性蛋白表达水平的变化。2、在体外ARPE-19细胞EMT模型的基础上,westem-blot检测KRT8和p-KRT8表达水平,并在TGF-β2刺激前转染si-KRT8,western-blot检测EMT标志性蛋白表达水平。同时,分别对ARPE-19细胞自噬(3-MA、Baf-A1和si-ATG5)和KRT8及其磷酸化(si-KRT8)水平进行干预,TGF-β2刺激后westem-blot检测自噬标志性蛋白(LC3-Ⅱ和p62)、KRT8和p-KRT8的表达水平变化,并利用细胞免疫荧光进一步检测细胞中p-KRT8的表达水平。最后,TGF-β2刺激前ARPE-19细胞分别转染KRT8表达质粒(KRT8-WT)和磷酸化失活质粒(KRT8-S74A),westem-blot检测自噬标志性蛋白表达水平,共聚焦显微镜观察mRFP-GFP-LC3荧光水平,细胞免疫荧光检测LC3B和LAMP2在细胞内的共定位情况。3、收集临床上PVR患者的视网膜增殖膜样本,免疫荧光技术检测其中KRT8和自噬标志性蛋白LC3B的表达情况。结果:1、TGF-β2可以诱导ARPE-19细胞表达EMT标志性蛋白α-SMA、fibronectin和collagenⅣ,并且细胞形态出现纤维化样改变。同时,TGF-β2促使自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ、Atg5-12和Beclin 1表达增加,p62降解增加,细胞内GFP-LC3荧光斑点增多;Baf-A1预处理可以进一步增加LC3-Ⅱ表达,且mRFP-GFP-LC3中黄色和红色荧光斑点增多。另外,预先加入自噬抑制剂(3-MA和Baf-A1)或转染特异性siRNA(si-ATG5和si-BECN1)干扰ARPE-19细胞自噬活性,明显抑制TGF-β2诱导的细胞迁移能力增强和EMT标志性蛋白表达增多。2、TGF-β2可以促进ARPE-19细胞中p-KRT8表达增加,而不影响KRT8表达水平。同时,转染si-KRT8可以抑制TGF-β2诱导的ARPE-19细胞EMT标志性蛋白表达增多。在TGF-β2刺激前,加入3-MA或转染si-ATG5阻断自噬起始阶段,可以使ARPE-19细胞中p-KRT8表达减少,而加入Baf-A1阻断自噬后期阶段则进一步增加p-KRT8表达水平;转染si-KRT8可以使LC3-Ⅱ表达增加,而p62降解减少。另外,相比KRT8-WT,转染KRT8-S74A的ARPE-19细胞在TGF-β2刺激后LC3-Ⅱ表达增加,而p62降解减少,并且mRFP-GFP-LC3中黄色荧光斑点增多,LC3B和LAMP2共定位减少。3、免疫荧光结果显示,视网膜增殖膜组织中KRT8和LC3B均有较高水平表达,并且两者存在明显的共定位。结论:1、TGF-β2可以同时诱导ARPE-19细胞发生EMT和自噬,调控自噬可以有效逆转其EMT过程。2、TGF-β2可以促进ARPE-19细胞中KRT8的磷酸化,且KRT8磷酸化通过影响自噬过程中自噬小体—溶酶体的融合,间接参与调控EMT过程。3、在PVR患者视网膜增殖膜组织中KRT8和LC3B高表达且存在共定位,与体外实验结果一致。