肝细胞肝癌是全球肿瘤病人死亡的主要原因之一，其中一半以上发生在中国。肝癌总的5年生存率不足5％。肝癌病人确诊越晚，其预后效果越差。由于肝癌的晚期诊断严重限制了肝癌治疗手段的选择，因此肝癌的早期发现非常重要。阐明肝癌发生机制将有助于寻找早期诊断肝癌的肿瘤标记物。 MicroRNA是一类可负性调控基因表达的非蛋白编码的RNA家族，能通过与mRNA分子相互作用阻遏蛋白质翻译或导致RNA的降解。成熟的miRNA是一种约19-25nt长的单链RNA分子，可通过完全或不完全碱基配对与mRNA分子3UTR端相结合，从而抑制靶基因的翻译，参与细胞一系列的重要过程，包括细胞分化、细胞增殖与细胞凋亡。越来越多的研究表明肿瘤细胞与癌旁组织来源细胞间miRNA表达谱具有明显差异，miRNA表达谱可将肝癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌及白血病与临近正常组织分开。重要的是发现半数以上的miRNA定位于与肿瘤发生相关的染色体区域和脆性位点，提示miRNA在肿瘤形成过程中可能扮演着重要的角色。miRNA在B细胞慢性淋巴细胞白血病相、Burkitts淋巴瘤、结肠直肠癌、肺癌与肝癌中均有异常表达。此外不同表达的miRNA还与肺癌病人手术后生存时间相关，且可以作为肺癌诊断与预后的分子标记物。miRNA还可能具有癌基因或抑癌基因的作用。这些研究均说明miRNA有望成为新的肿瘤标记物用于肿瘤诊断与预后评价。因此研究与肝癌发生、发展相关的miRNA表达谱的变化，探索肝癌发生发展的分子机制，这对肝癌的早期诊断和及时防治具有非常重要的意义。 在本研究中第一部分我们拟通过检测临床肝癌标本与癌旁组织标本中miRNA的表达谱，结合临床病例资料，总结miRNA差异表达状况与肝癌恶性生物学行为的关系，并以定量RT-PCR加以验证。在研究第二、三部分对筛选出的兴趣miRNA，以定量RT-PCR和Western-blotting分析其功能、及其相对应的靶mRNA和目的蛋白表达状况，探讨其在HCC发生发展中的作用机制。 第一部分利用液相芯片技术进行肝癌miRNA表达谱的研究：miR-338在肝癌组织中下调表达 目的：目前已经发现miRNA在许多肿瘤中失调表达，miRNA与肿瘤的发生密切相关。但miRNA在肝癌发生发展中的研究尚不多，本部分探讨miRNA在肝癌中的表达谱，以便更好理解肝癌的发生机制。 方法：通过液相芯片技术分析20对肝癌癌组织与其癌旁组织中114种miRNA表达谱差异。应用Hierarchical Cluster软件将31种差异表达的miRNA对20例患者进行聚类分析，利用Real-time RT-PCR在另外36对肝癌癌组织中验证miR-338下调表达及其与肝癌临床参数的相关性。 结果：在本实验中，液相芯片技术检测结果显示31种miRNA在肝癌组织与非肝癌组织间呈现差异表达，每种miRNA表达数值均与5S表达值相比进行标化。其中12种miRNA在癌组织中相对于在癌旁组织中上调表达，19种miRNA在癌组织中下调表达。应用Hierarchical Cluster软件将31种差异表达miRNA对20例患者进行聚类时，可基本将肝癌组织与毗邻癌旁组织分开。miR-338可明显将20例肝癌病人分成两组。根据miR-338表达谱，再结合以上临床病例详细资料分析、发现：miR-338下调表达程度还与HCC恶性程度、肿瘤分化程度、肝内和肝外转移及门静脉癌栓有关，miR—338下调程度在有血管侵袭与无血管侵袭病例组有显著性统计学差异(P=0.005)。miR—338在肿瘤>5cm组中表达更低与肿瘤<5cm组相比(P<0.001)；与无明显肝内转移病例中比较，miR—338在肝内转移病例中表达更低；miR—338的表达随着肝癌肿瘤级别与分化程度的升高而逐近降低。但与患者性别、AFP、HBsAg、是否合并肝硬变均无关。利用Real—time RT—PCR检测miR—338在另外36例肝癌病人癌组织与非癌组织中，转移癌组织与非转移癌组织、不同肿瘤级别间的表达。结果证实：miR—338在癌组织中的表达量明显低于非肿瘤组织、在伴有转移的肝癌组织中低于非转移性癌组织、miR—338的表达量随着肿瘤级别的增加逐近降低。 结论：肝癌组织与癌旁组织之间存在miRNA差异表达，其中miR—338下调表达程度还与肝恶性行为相关。如果miRNA表达谱可以用于诊断肿瘤，那么液相芯片技术将有可能成为一种大规模诊断肿瘤的方法。 第二部分MiR-338通过下调SMO抑制肝癌细胞的增殖与转移 目的：我们研究的第一部分已经证明了miR—338与HCC的相关性，但是它在HCC中的作用机制尚不清楚。由于目前还没有miR—338调控哪些信号通路及其在肿瘤发生中的功能研究，故本研究对在HCC中下调表达的miR—338进行更深入的研究。 方法：应用分子生物学方法预测miR—338靶基因。常规培养人肝细胞(BEL—7402，SMMC—7721，Skhep-1，PLC，Hep3B，Huh7和LO2)。定量RT—PCR检测SMO、GLI1、MMP9的表达量。进行脂质体瞬时转染后，肝癌细胞的增殖能力与迁移迁袭能力的改变分别应用MTT与Transwell及划痕实验进行检测。应用Hoechst33258和流式细胞仪检测细胞的凋亡及细胞周期的改变。Western—blotting用于检测SMO、GLII、MMP9蛋白水平的改变。 结果：采用TargetScan和miRanda网站预测到SMO为miR—338的靶基因。荧光定量PCR结果显示，miR—338在肝癌细胞株中发生不同程度的下调。而伴随着SMO、GLI1表达量的上升，SMO是Hh信号通路的控制“开关”，SMO异常过表达将激活其下游的GLI1转录因子，从而激活Hh信号通路。Hh信号通路参与多种人类肿瘤的发生发展。显然，在肝肿瘤细胞中miR—338的表达与SMO的表达、与Hh信号通路的活化呈负相关。我们在SMMC—7721和Skhep-1细胞株中对miR—338和SMO关系进行更深入的研究。发现转染pre—miR—338到这两种细胞中恢复miR—338的表达将剂量依赖性地降低SMO mRNA和蛋白的表达；而转染inhibitor—miR—338到这两种细胞中抑制miR—338的表达将剂量依赖性地升高SMOmRNA和蛋白的表达。这说明miR—338可以在转录水平抑制SMO的表达。 有趣地是提高细胞内miR—338表达抑制SMO、GLI1 mRNA和蛋白的表达，同时减弱了细胞的增殖、侵袭与转移能力。也降低了GLI1下游因子MMP9的mRNA及蛋白的表达，MMP9参与细胞的迁移与迁袭过程。与之相反的是，抑制细胞内miR—338表达则促进SMO、GLI1 mRNA和蛋白的表达，同时增强了细胞的增殖、侵袭与转移能力。也提高了GLI1下游因子MMP9的mRNA及蛋白的表达。而使用SMO特异性抑制剂cyc(也是Hh信号通路抑制剂)可以逆转inhibitor—miR—338提高肝癌细胞增殖与迁袭能力的作用。同时inhibitor—miR—338对Glil和MMP9表达升高的效应也被逆转。而在肝癌细胞中单独使用cyc，则癌细胞增殖与迁袭能力被抑制，发生与转染pre—miR—338到细胞中相当的结果。 应用流式细胞仪检测miR—338对SMMC—771和Skhep1细胞周期及凋亡的影响，结果发现转染pre—miR—338增加细胞内miR—338表达之后，G0/G1期延长，S期相应缩短；与之相反的是转染inhibitor—miR—338降低细胞内miR—338表达之后，G0/G1期缩短，S期相应延长；而使用cyc后，则取消inhibitor—miR—338对癌细胞周期的影响。无论转染pre—miR—338还是inhibitor—miR—338都对G2/M期无明显影响。且Hoechst33258染色检测，发现无论转染pre—miR—338还是inhibitor—miR—338，肝癌细胞均未出现核浓缩、核碎裂等典型的凋亡现象。 结论：以上结果证实miR—338下调SMO基因的表达，进而抑制Hh信号通路，及其下游的转录因子GLI1和MMP9。miR—338可以抑制肝癌细胞的生长与癌细胞的侵袭与转移，可以将细胞周期阻止在G0/G1期，但对其凋亡无影响。这些结果说明在肝癌中异常表达的miR—338通过抑制SMO，进而作用于Hh信号通路改变肿瘤细胞的生物学行为如细胞增殖、迁移与迁袭能力。综上说明miR—338在HCC的发生发展中发挥抑癌基因的作用，这将为HCC的诊断与治疗带来新的曙光。 第三部分MiR-338靶向调节基因SMO的机制研究 目的：探讨肝癌细胞中miR—338对SMO的作用机制。 方法：构建含SMO3UTR结合位点的荧光素酶报告载体，与miR—338表达载体共转染，检测细胞中的荧光素酶活性。 结果：成功构建含SMO3UTR结合位点的荧光素酶报告载体，miR—338表达载体与含SMO3UTR结合位点的报告载体共转染可以抑制细胞中的荧光素酶活性，增加荧光素活性比值。 结论：肝癌细胞中miR—338与SMO3UTR端相结合抑制SMO的表达。