近年来，随着干细胞生物学研究的不断深入，干细胞移植成为新近发展的一种治疗AMI的全新策略。 干细胞是一组具有自我更新和多向分化潜能的细胞。根据其来源不同可分为胚胎干细胞、胎儿干细胞及成体干细胞。成体干细胞由于无伦理问题的争议而被广泛研究。在成体干细胞中，对骨髓间充质干细胞研究最早，因其具有较强的增殖和分化能力而作为干细胞移植治疗AMI可选择的来源之一。然而，因取骨髓时患者比较痛苦，从骨髓中获取的BMSCs数量甚少，限制了BMSCs的进一步临床应用。脂肪干细胞具有同BMSCs相似的生物学特性，可被诱导分化为骨、软骨、肌肉、神经等多种细胞类型。同时ADSCs具备来源丰富、可反复取材、痛苦小、体外易扩增、免疫原性低等优点而成为优于BMSCs的种子细胞。另外，ADSCs不仅能分化为内皮细胞参与血管的形成，还能分泌多种促血管生长因子如血管内皮生长因子和肝细胞生长因子，因此可应用于治疗性血管生成。有研究表明BMSCs能抑制肺、肾、肝等器官组织纤维化及炎症反应。ADSCs是否同样具备抑制组织纤维化及炎症反应的作用？如何最大程度发挥ADSCs治疗性血管生成及抗纤维化的作用尚需进一步探讨。 HGF是间质细胞衍生的一种多功能因子，能促进细胞分裂、迁移以及形态的发生，是形成、维持、重塑多细胞组织结构的重要血管营养因子。HGF对许多细胞类型有很强的促有丝分裂、促血管新生、抗凋亡和抗纤维化作用。许多研究揭示HGF是一内源性心肌保护因子。当机体发生AMI时，HGF能保护心肌细胞免受急性缺血损伤，加强心肌细胞抵抗氧化应激的能力。最近研究者发现HGF对梗死后心力衰竭的改善作用不仅仅局限于刺激血管生成、抗纤维化及抗凋亡，而且能增加干细胞募集于损伤心肌处。AMI时心肌细胞坏死，为了补充肥大心肌细胞或死亡的心肌细胞而致间质胶原纤维增生、蓄积，进而促使心肌及小动脉扩张、功能障碍，导致心肌血流量降低。因此，HGF促血管新生和抑制纤维化作用可能会在更大程度上改善AMI患者的心功能。 本课题通过原代培养方法，对hADSCs进行分离、体外培养，用流式细胞仪进行细胞表面抗原标记物鉴定，并进行成脂成骨诱导分化，确定其多向分化潜能。构建携带hHGF的慢病毒重组体，并成功感染hADSCs。制作SD大鼠AMI模型，于模型制作成功后24h经尾静脉输注hADSCs或过表达hHGF的hADSCs，模型对照组及假手术对照组输注等量的生理盐水，分别于移植后7d、14d、28d超声心动图检测各组大鼠的心功能，于移植后28d观察细胞移植组大鼠hADSCs心肌归巢情况及向内皮细胞分化情况，检测各组大鼠心梗区HGF蛋白水平，心肌毛细血管密度，纤维化情况，Ⅰ、Ⅲ型胶原及TNF—α、TGF—β1mRNA的表达水平，为AMI乃至缺血性心脏病的临床治疗提供新策略或新的治疗手段。 第一部分：hADSCs的分离、体外培养及鉴定 目的：进行hADSCs的分离、体外培养及鉴定，为再生医学的进一步研究提供实验依据。 方法：通过原代培养方法，对hADSCs进行分离、体外培养。选取第2代及第5代细胞，用MTT法检测细胞活性，绘制细胞生长曲线；用流式细胞仪进行细胞表面抗原标记物鉴定。选取P5细胞，分别进行成脂及成骨诱导分化，确定其多向分化潜能。 结果：P2及P5细胞生长曲线表明hADSCs生长于第1～3d时处于起始期，第4～7d出现第1个对数生长期，第7d时生长达到高峰。在第8、9d出现生长停滞、下降，第10～12d再次出现对数生长。该结果表明，hADSCs生长特性为生长具有多对数生长期，无明显的接触抑制。 P5代hADSCs成脂诱导3w后，油红O染色可见细胞内大量的红色脂滴；成骨诱导3w后，茜素红染色阳性，证实钙化结节形成。表明hADSCs可向成脂成骨诱导分化，具有多向分化潜能。 结论： 1、利用原代培养技术可成功从人脂肪组织中分离出ADSCs。 2、hADSCs生长特性为生长具有多对数生长期，无明显的接触抑制。 3、hADSCs表达干细胞抗原标记，免疫原性低，且具有成脂、成骨多向分化潜能。 第二部分：携带hHGF的慢病毒载体的成功构建与感染hADSCs 目的：构建携带hHGF的慢病毒载体，并成功感染hADSCs，为干细胞途径基因治疗提供理想的载体。 方法：携带hHGF的pcDNA3.0质粒,慢病毒载体系统由pGC—E1-GFP载体、pHelper1.0载体，pHelper2.0载体三质粒组成。应用PCR方法从pcDNA3.0-hHGF质粒上扩增hHGF并连接至pGC—E1-GFP载体的AgeⅠ位点。菌液PCR及DNA测序鉴定阳性克隆连接。用Lipofectamine2000将pHelper1.0、pHelper2.0和pGC—E1-hHGF或pGC—E1-GFP质粒DNA共转染293T细胞，8h后更换新鲜培养液。继续培养48h在荧光显微镜下观察荧光表达情况。Lenti—hHGF或lenti—GFP包装成功后收获病毒并浓缩，使用逐孔稀释滴度测定法测定病毒滴度。接种hADSCs于96孔培养板中，分别以MOI值为50、100和200感染细胞，并添加5ug/ml的polybrene，48h后更换新鲜培养基。感染后4～5d，于荧光显微镜下观察GFP表达情况。选取MOI值为200用于移植细胞的感染。移植前流式细胞仪测定GFP阳性细胞比率，western blot检测感染细胞HGF的蛋白水平。 结果：经菌液PCR及DNA测序鉴定结果表明hHGF序列正确，并成功连接至pGC—E1-GFP载体上。 三质粒共转染293T细胞56h后，荧光显微镜下可见GFP表达，阳性包装细胞达～80％。收获病毒并浓缩后，测定病毒滴度为1×108TU/ml。 慢病毒感染hADSCs后，荧光显微镜下观察显示，MOI值为200较MOI值为50及100的感染率高。选取MOI值为200用于移植细胞的感染。流式细胞仪检测移植前细胞GFP阳性率为(53±15)％，western blot检测感染lenti—hHGF的细胞HGF蛋白水平较感染lenti—GFP的细胞约增高50％。 结论： 1、携带hHGF的慢病毒载体构建成功。 2、Lenti—hHGF能高效感染hADSCs，并使其过表达HGF。 第三部分过表达hHGF的hADSCs对AMI大鼠血管新生和抗纤维化作用研究 目的：了解hADSCs移植能否通过促血管新生和抑制纤维化作用改善AMI大鼠的心功能，及hADSCs联合hHGF治疗能否加强上述作用，为AMI的临床治疗提供新的治疗手段。 方法：选取200～250g SD大鼠，分为假手术对照组，AMI/PBS组，AMI/ADSC组，AMI/ADSChHGF组。开胸结扎左冠状动脉前降支制作AMI模型，Sham组大鼠只开胸而未做动脉结扎。模型制作成功后24h，AMI/ADSC组或AMI/ADSChHGF组大鼠分别经尾静脉输注感染lenti—GFP的ADSCs或感染lenti—hHGF的ADSCs，每只大鼠输注1×108个细胞。AMI/PBS组大鼠输注等量的PBS。分别于移植后第7d、14d、28d用超声心动图检测各组大鼠的心功能，于移植后28d观察细胞移植组大鼠ADSCs心肌归巢情况及向内皮细胞分化情况，western blot检测各组大鼠心梗区HGF蛋白水平，免疫组织化学染色检测各组大鼠心梗区心肌毛细血管密度，masson染色检测心肌纤维化情况，并用RT—PCR及荧光定量PCR检测各组大鼠心梗区Ⅰ、Ⅲ型胶原及TNF—α、TGF—β1mRNA表达水平。 结果：大鼠结扎左冠状动脉前降支后，左室前壁心肌立刻由鲜红色变为暗红色甚至苍白色，术后24h心电图出现病理性Q波，ST段弓背向上抬高，提示大鼠AMI模型制作成功。 细胞移植后第7d、14d、28d，与Sham组比较，AMI/PBS组大鼠左室腔明显增大，左室射血分数及缩短分数均明显下降。虽然AMI/PBS组大鼠％EF及％FS14d时较7d时有所增加，但是在28d时又出现下降。与AMI/PBS组比较，AMI/ADSC组和AMI/ADSChHGF组大鼠同一时间点左室％EF及％FS均明显升高，左室舒张末期内径和左室收缩末期内径均明显减少。移植后第7d和第14d时AMI/ADSC组和AMI/ADSChHGF组大鼠各项心功能指标未见明显差异，第28d时AMI/ADSChHGF组大鼠左室％EF及％FS较AMI/ADSC组大鼠明显增加。 细胞移植后第28d，AMI/ADSC组和AMI/ADSChHGF组大鼠左室心肌均可见到GFP阳性细胞，CD31免疫组化检测显示GFP阳性细胞同时表达内皮细胞标记CD31。 细胞移植后第28d，与AMI/PBS组比较，AMI/ADSC组和AMI/ADSChHGF组大鼠心梗区HGF蛋白水平增高，毛细血管密度增加，心肌纤维化程度降低，心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原及TNF—α、TGF—β1mRNA表达水平降低。且AMI/ADSChHGF组上述指标较AMI/ADSC组改善明显。 结论： 1、在无使用免疫抑制剂的情况下，静脉移植hADSCs可通过分化为血管内皮细胞、促血管新生、抑制炎症反应及抗纤维化作用改善AMI大鼠心功能。 2、hHGF可增强ADSCs在AMI中的治疗作用。