围产期窒息所致的缺氧缺血性脑病(Hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)是导致新生儿死亡的常见原因，存活者常遗留严重的后遗症。HIE后神经元的死亡发生于两个不同的阶段：第一阶段为原发性神经元死亡，在窒息后早期发生，是由于缺氧缺血导致的细胞溶解坏死；第二个阶段为迟发性神经元死亡，发生在几小时之后。现在认为迟发性神经元死亡即为凋亡。因此，进一步对HIE后的凋亡进行研究，探讨HIE后凋亡的防治问题很有必要。 胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1, IGF-1)是神经营养因子中的一种，具有非选择性的神经营养作用。研究表明，IGF-1能减轻多种病理变化下神经元的凋亡。但IGF-1对新生动物缺氧缺血后神经元凋亡的影响及其剂量—效应关系目前报道较少。本课题在建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)模型后以不同剂量IGF-1侧脑室用药，观察其对神经元凋亡的作用，并且通过检测不同组之间大脑组织的死亡蛋白酶caspase-3活性亚单位P20表达的变化，对IGF-1的抗凋亡机制进行研究。 材料与方法 1．HIBD动物模型：取新生7d龄SD大鼠，体重12～14g，结扎左颈总动脉后放入低氧舱(含8％氧气)中2h。 2003年浙江大学硕士研究主毕业论文 2．实验分组及干预方法：HIBD后Zh将新生大鼠按体重编号，对照随机数字表分为 三组：干预 1组、干预 2组和对照组。分别在其左侧侧脑室内注射 in g、5 n g的 IGFI 及等体积的PBS。注射部位为人字缝尖向嘴侧2刀mm，左侧1．smm，垂直2刀nun。 3．细胞凋亡及caspase－3表达的检狈 O）透射电镜法：HIBD后 24h处死动物，取缺血侧大脑皮层和海马新鲜组织各 lmm3 左右的标本。标本处理后通过 TECNAI型透射电镜观察正常、凋亡以及坏死神经元的形 态。 p）TUNEL法：HIBD后 24h处死动物，取缺血侧脑组织制成石蜡切片后用 TUNEL 法检测凋亡细胞。采用NBT显色，细胞核染成蓝黑色为TUNEL阳性细胞。在400倍光镜 下计数 TU’NEL阳性细胞数。每样本取 15个视野以上，大脑皮层计数 3000个，海马计数 1000个。 o）Western blot法：HIBD后 24h，取缺血侧大脑组织经裂解及蛋白浓度测定后上0℃ 保存。实验时每样本取 80 u g蛋白质，经 SDS－PAGE电泳及电转移后，分别加入羊抗 caspase习多克隆抗体及抗羊IgG。使用ECL显影。胶片扫描后采用NIH图象处理软件半 定量分析光密度。 4．统计学处理：采用 SPSS 10刀统计软件包非参数检验，三组间比较用 Kluskal－Wallis 法，两两比较用Mann－Whitney法。结 果 1．电镜结果 PBS对照组的缺血侧大脑皮层和海马内可见较多具有明显凋亡特征的细胞及部分坏死细胞。两个IGF．l用药组的凋亡细胞相对较少。 2．不同剂量IGF－l对大脑皮层和海马神经元TU’NEL阳性细胞数的影响 在大脑皮层，计数3000个细胞，对照组、干预1组和干预2组的TUNEL阳性细胞数 的中位数（四分位数间距）分别为：114．0（59．5）、44．5（28．8）和36．5（21．6）。在海马， 计数 1000个细胞，对照组、干预 1组和干预 2组的 TUNEL阳性细胞数的中位数（四分位 数间距）分别为：29．0（23．2）、8．5（7．5）和 ZI．0（17．4）。两个mF－l干预组大脑皮层和 海马神经元的TUNEL阳性细胞数均明显少于缺氧缺血后注射PBS的对照组，差别有显著 2 2003年浙江大学硕士研究生毕业论文性意义（尸＜0刀5人在海马，干预 1组即 illg IGFI组的 TUNEL阳性细胞数明显少于干预2组即 5卜 g IGFI组，差另有显著性意义（尸＜0刀5）。 3．不同剂量 IGFI对大脑 caspasel P20亚单位表达的影响 三组间 caspase习 P20亚单位的表达不尽相同。对照组、干预 1组和干预2组caspaselP20亚单位的光密度的中位数（四分位数间距）分别为 108．9（198．4）、5．1（12．4）和 27．5 （41．1）。干预 1组 P20亚单位的光密度明显低于干预 2组和对照组，差别有显著性意义（尸＜0刀5）。结 论 1．IGFI对新生大鼠HIBD后神经元的凋亡有一定的保护作用，是一种较好的神经营救因子； 2．IGFq的抗凋亡作用与caspase刁活性亚单位P20的下降紧密相关； 3．IGFI的神经元保护作用与剂量有一定的关系，in g IGFI比 5 u g IGFI效果更佳。