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目的:随着社会快速发展,人们的生活水平逐渐提高,酒类饮品的消耗不断增加,广泛饮酒严重损害公众健康,而饮酒后的一系列社会行为也产生了社会公共安全问题。长期饮酒可以引起机体多系统、多器官的损害,尤其对于中枢神经系统的损害较为严重,这种损害表现为计算能力下降、记忆力下降、反应迟钝、认知功能受损等神经退行性变症状,严重的甚至发展为酒精性痴呆。Tau蛋白是一种在神经系统中广泛存在的微管相关蛋白(microtubule associated proteins,MAPs),主要存在于神经元的胞质及轴突中,也存在于其他的神经细胞中,起到促进微管形成和稳定微管结构的作用,从而维持正常轴突运输营养物质及代谢产物。同时,Tau蛋白作为神经系统的生长发育和轴突信号传导过程中必不可少的微管相关蛋白,起到促进神经细胞生长、发育的作用,并参与神经元极性的形成和轴突生长过程。但当其过度磷酸化后,磷酸化后的Tau蛋白与微管结合能力降低,使微管稳定性下降,并且容易聚积成异常结构的双螺旋细丝,导致正常的轴突转运发生障碍,进而影响神经元的形态,损害神经元的功能,最终引起神经退行性变。Tau蛋白异常磷酸化位点较多,在神经退行性变中Ser396位点、Ser202位点及Thr205位点的磷酸化水平较高。AT8是一种磷酸化Tau蛋白特异性单克隆抗体,识别异常磷酸化的Tau蛋白(Ser202/Thr205),是神经病理学的常用标志物,也是用于评估病态Tau的广泛使用的抗Tau蛋白抗体之一。正常情况下,蛋白磷酸激酶和磷酸酯酶(protein phosphatases,PPs)共同直接作用于Tau蛋白磷酸化过程,两者有着相反的作用,确保其维持在正常水平,发挥正常的生物学功能。糖原合成激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)和细胞周期蛋白依赖激酶5(cyclin-dependent kinase 5,CDK5)是直接诱导Tau蛋白磷酸化最重要的磷酸激酶。CDK5的一个比较重要的特异性激活子为P35。抑制Tau蛋白磷酸化即促进其去磷酸化的蛋白磷酸酯酶(protein phosphatases,PPs)主要包括:PP1、PP2A、PP2B和PP5。其中PP2A在调节Tau蛋白去磷酸化的过程中表现出来的相对活性最高,因此,PP2A是主要的磷酸酯酶。本课题组的前期研究结果初步显示慢性乙醇暴露能引起细胞内钙离子内流、超载,并使1,4,5-三磷酸肌醇受体(inositol-1,4,5-triphosphosate receptor,IP3R)和N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)表达增强,导致小鼠神经细胞凋亡,引起空间记忆能力受损。但慢性乙醇暴露是否引起Tau蛋白过度磷酸化及何种磷酸激酶和(或)磷酸酯酶在其过程中起主要作用等有待进一步研究。为研究慢性乙醇暴露对Tau蛋白及其磷酸化表达变化的影响,本实验应用慢性乙醇暴露动物模型,观察乙醇对小鼠海马中Tau蛋白总量、磷酸化Tau蛋白表达、磷酸化Tau蛋白占Tau蛋白总量的比例、GSK-3β活性、CDK5活性及PP2A活性变化的影响,以阐述慢性乙醇暴露时Tau蛋白总量、Tau蛋白磷酸化水平以及相关调节激酶和酯酶活性变化,为慢性乙醇暴露引起的神经损害提供实验资料。研究方法:本研究采用动物实验:选取120只成年雄性C57BL/6小鼠,按照乙醇饮用浓度的不同随机分为3组:对照组(不含乙醇)、10%乙醇组和20%乙醇组(m/v);按照乙醇自由饮用时间随机分为4组:30d、60d、90d、180d组。共12组,每组10只。应用免疫组化方法检测海马中Tau5、p-Tau(Ser396)、p-Tau(Thr205)、p-GSK-3β(Ser9)的表达及定位分布变化;应用Western blot方法检测海马组织中Tau5、AT8、p-Tau(Ser396)、d-PP2A、CDK5、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)、p-GSK-3β(Tyr216)、P35的蛋白表达变化。结果:免疫组织化学染色结果显示,各乙醇饮用组p-Tau(Thr205)、p-Tau(Ser396)染色与各对照组相比强度升高,信号表达增强,呈棕黄色;Tau5染色与对照组相比染色强度基本不变,信号表达无明显变化;p-GSK-3β(Ser9)染色与对照组相比强度明显降低,信号表达较弱,呈淡棕黄色。Western blot实验结果显示,各乙醇饮用组随着乙醇浓度的升高AT8、p-Tau(Ser396)蛋白表达水平总体逐渐升高,Tau5蛋白表达总体没有明显变化;p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达水平总体逐渐降低,d-PP2A、CDK5、GSK-3β、p-GSK-3β(Tyr216)、P35蛋白总体没有明显变化。结论:1、慢性乙醇暴露引起小鼠海马细胞中Tau蛋白在Ser396和Thr205位点过度磷酸化。2、慢性乙醇暴露引起小鼠海马细胞中GSK-3β在Ser9位点的磷酸化水平降低。3、慢性乙醇暴露引起的Tau蛋白在Ser396和Thr205位点过度磷酸化可能与GSK-3β活性升高有关。