我国拥有世界上最多的家蚕突变资源,但对大规模的功能基因组研究来说还远远不够,而且这些突变资源中的大多数是自然突变品种。因此,通过人工诱发突变获得更多的突变体资源,为功能基因研究提供丰富的材料,是当前的重要工作之一。现有研究表明,在家蚕蛹和成虫期利用化学诱变诱导效果雄体好于雌体,但在幼虫期诱导由于技术问题尚未获得成功,探索一种在幼虫期诱导雄蚕生殖细胞突变的方法十分必要。生殖细胞担负着保证后代遗传稳定性的特殊任务,因此在生殖细胞形成过程中对基因突变的修复要比普通体细胞更为重要。而且生殖细胞形成过程中具有其他体细胞所没有的减数分裂过程,普遍认为减数分裂具有“复壮作用”,这意味着在此过程中可能存在着特殊的、更为高效的基因修复机制,但目前并没有直接的试验证据。有鉴于此,本文研究探讨了硫酸二乙酯(Diethyl sulfat,DES)和亚硝酸钠在雄蚕生殖细胞进行减数分裂前后诱导突变体的效果。另一方面,通过体内和体外试验,利用过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)诱导不同发育阶段雄性生殖细胞产生DNA损伤,通过单细胞凝胶电泳(single cell gel eletrophoresis,SCGE)和荧光定量PCR(Realtime quantitative PCR,RT-qPCR)等方法探讨了雄性生殖细胞在减数分裂之前、减数分裂期及精细胞形成之后对DNA损伤的修复能力及修复机制。主要获得如下结果:1.给予3龄36 h及5龄120 h雄蚕注射25-800μg/g剂量的DES诱发突变,与对照组相比发育有不同程度延缓,死亡率明显增加,化蛾后交配率和产卵率下降,死卵率增多,在M1代各虫态未发现突变体,从M2代中发现了畸形幼虫和畸形蛹变异个体,但均未能完成变态而死亡,因而未能获得突变体后代。本试验说明,家蚕幼虫期注射适宜剂量DES,家蚕能够存活,而且可以诱发变异。2.给3龄及5龄雄蚕添食10-40 mg/mL的NaNO2以诱导变异,添食浓度在10-20mg/mL时,蚕全部存活,但表现出明显毒性,添食浓度为40 mg/mL时蚕全部死亡。对存活的雄蚕饲养继代,在后代中均未发现变异个体。亚硝酸钠对家蚕的诱变效果有待进一步研究。3.在雄蚕生殖细胞处于不同发育阶段的3龄36 h(多数生殖细胞处于减数分裂前的初级精母细胞阶段)、4龄48 h(多数生殖细胞处于减数分裂过程中)、5龄120 h(多数生殖细胞已经完成减数分裂形成精细胞并开始进入变形期)及化蛹6天(多数生殖细胞已经变形成为精子)4个阶段给蚕注射H2O2诱发DNA损伤,测定睾丸中AP核酸内切酶基因(AP endonuclease,APE)的相对表达量变化。结果表明,不同时期注射H2O2的影响不完全一致,除5龄期之外,其他3个时期注射生理盐水的对照组及低剂量H2O2处理组,在注射后10-30 min均引起APE基因表达上调,此后下降到正常水平,但高剂量H2O2处理组对APE基因表达的影响反而较小。根据本试验结果推测,H2O2注射入蚕体之后,可能在没有进入睾丸作用于精细胞之前就已经被H2O2酶分解,即不能引起生殖细胞的DNA链断裂等损伤而引发修复机制的发生。而高剂量H2O2可能严重影响了家蚕的生理,甚至引起细胞死亡等严重损伤,从而导致DNA修复能力减弱或丧失。4.取3龄36 h、4龄48 h、5龄120 h雄蚕睾丸的生殖细胞在体外进行短期培养并加入H2O2染毒,诱导DNA损伤,然后清除H2O2继续培养,在经过不同时间后取样,利用SCGE技术测定细胞DNA损伤和修复情况。结果表明,H2O2染毒造成的细胞损伤率以4龄48 h最低,但3个时期并无显著性差异;而在正常培养基中培养修复10 min后,4龄48 h的生殖细胞修复率最高,其次为3龄36 h的细胞,5龄120 h的精细胞损伤率显著高于4龄期的细胞;在修复15 min和20 min时,3龄蚕生殖细胞的损伤率则极显著高于另外两个时期的细胞;修复时间达到30 min后,不同发育时期的生殖细胞绝大部分均已经修复。说明大多数处于减数分裂时期(4龄48 h)的精母细胞对H2O2引起的DNA损伤的修复能力最强,其次为精细胞形成后的5龄120 h,尚未进行减数分裂的精原细胞和初级精母细胞(3龄期精细胞)的修复能力最差。5.测定了4龄48 h、5龄120 h的雄性生殖细胞在体外用H2O2染毒处理后修复酶基因APE和DNA连接酶基因(DNA Ligase,DNA Lig)的表达变化。结果表明,4龄48 h和5龄120 h的生殖细胞中APE和DNA Lig基因的表达量变化趋势基本相同,均在染毒处理后30或60 min内相对表达量下调,60或90 min以后上调,但5龄蚕生殖细胞的DNA Lig基因表达上调幅度没有达到未染毒处理时的水平。与SCGE测定结果比较可见,在生殖细胞DNA修复期间,APE和DNA Lig修复酶基因的表达不仅没有上调,反而下调,表达上调的时间明显滞后,而且上调幅度较小。因此推测,在生殖细胞从精母细胞到精子形成的过程中,DNA损伤可能存在其他的修复机制,对此还有待于进一步研究。