背景与目的:近年来关于端粒的研究较为深入。端粒是真核生物染色体线性DNA分子末端的特殊结构,由（TTAGGG）n反复串联组成,其功能主要是维持染色体稳定,其长度主要由端粒酶来维持。90年代以来,端粒及端粒酶逐渐被认可作为肿瘤的标记物以及抗肿瘤治疗的靶点。有关恶性血液病患者骨髓及外周血细胞端粒长度（telomere length,TL）及端粒酶活性的研究亦有较多报道。多数文献认为,急性白血病初诊时端粒较短而完全缓解后端粒长度可恢复正常,高危核型者端粒缩短更明显,端粒短者化疗缓解率相对下降,中位生存期短;CML慢性期端粒正常或缩短,进展至急变期时,端粒显著缩短,应用STI571治疗后端粒长度有所恢复,慢性期端粒短者易发生急变及对STI571耐药;CLL早期端粒正常或轻度缩短,随病情进展,端粒不断缩短,高危核型、高表达CD38或ZAP-70、原始IgVH基因型的患者端粒缩短更明显,端粒短者中位生存期短;MDS随病情进展,端粒亦缩短,且初诊时端粒缩短提示易早期转变为急性白血病。因此,了解恶性血液病患者的端粒长度对于监测疾病状态、评估预后、指导治疗具有重要意义。伴随端粒研究的深入,有关端粒长度检测方法的改进,也成为临床工作者关注的热点。流式荧光原位杂交（flow cytometry-fluorescence in situhybridization,FLOW-FISH）是近年来发展的检测端粒长度的新方法,国内开展很少,国外也起步不久,主要特点是将流式细胞术（flow cytometry,FCM）和荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）结合起来。因端粒由重复序列（TTAGGG）n反复串联组成,故其越长,在FISH中所结合的荧光素标记的（CCCTAA）₃端粒DNA序列特异性探针就越多,其荧光也就越强,由流式细胞仪检测的此种平均荧光强度即可表示端粒长度。该方法较经典的Southern印迹杂交（Southern blot）、定量荧光原位杂交（quantitativefluorescence in situ hybridization,Q-FISH）,所需样品量小、细胞数少（10⁵）,可用于检测不分裂细胞,操作快捷,可区分同一份标本中的不同细胞亚群,并且检测时高通量细胞,灵敏度高,特异性强,重复性好。国外的研究多利用FLOW-FISH单独检测端粒长度,未结合患者白血病细胞表面分化抗原的表达特点,研究结果多提示整个细胞群端粒长度变化的均值,而不能区分端粒明显缩短、但为数极少的白血病细胞与端粒长度正常、但占绝大对数的正常细胞,因此在白血病微小残留病（minimal residual disease,MRD）检测时意义可能有限。此外,随着疾病进展、治疗实施,白血病患者的造血组织中同时存在的正常克隆和异常克隆之间、异常克隆的不同亚克隆之间可能发生“消”与“涨”,并且出现复发时白血病细胞的生物学特点可发生变化,可能出现系列的转变,此时如果单独检测端粒长度,则难以尽早地对这种克隆演变进行监测。另一方面,单独检测细胞表面分化抗原,虽然在初发白血病的免疫学中意义重大,但追踪MRD时,则很难区分表达同样分化抗原的白血病细胞和正常造血细胞,难以对白血病MRD进行真正准确的判断。MRD是白血病监测的重要内容,而不是所有的患者都具有某种特异性的细胞遗传学或分子生物学标记,大部分患者没有很好的MRD检测指标,因此寻找一个可广泛应用的方法非常必要和迫切。FCM通过白血病相关免疫表型检测MRD具有其显著优势,制约其广泛开展的主要原因如上所述,即不能区分造血细胞中的正常克隆和残存的异常克隆,因此如能寻找一个能够区分正常和异常克隆的指标进行联合检测,结合FCM具有的适用范围广、操作快捷、价格相对便宜、信息量大、易于直接准确定量的优势,将为临床白血病的监测、诊治提供极大的帮助。本课题设想,在本实验室建立较稳定可靠的检测细胞端粒长度的FLOW-FISH方法,初步观察由此测定的端粒长度与白血病的关系,探讨有关的白血病发生发展机制。此外,应用FLOW-FISH检测端粒长度的同时,检测同一标本中有关细胞表面分化抗原的表达情况,以期使单纯的FCM技术和FISH技术得到有机结合,从而使白血病细胞的免疫表型异常与端粒长度异常结合起来,协同作为监测疾病状态、评估预后的指标,进而寻找一个可以广泛应用的监测白血病MRD的新方法,为进一步的诊疗计划提供依据。方法:1.培养HL60、Raji、Molt4细胞株,对FLOW-FISH检测细胞端粒长度及联合检测表面分化抗原各个实验步骤进行摸索、优化、标准化,克服有关技术难点,制定相关操作规程及分析策略。临床标本相对端粒长度（relative telomerelength,RTL）以标本相对于同批上机的Molt4细胞株的端粒平均荧光强度（平均荧光道数值）的比值表示,计算公式如下:2.研究对象:所有白血病标本均取自经细胞形态学、免疫分型、细胞遗传学确诊的34例患者。对照组为年龄、性别匹配的健康者20例。3.提取白血病患者骨髓及健康对照者外周血单个核细胞,分组进行FLOW-FISH。14例急性白血病患者治疗前后均联合检测细胞端粒长度和表面分化抗原,分化抗原根据初发时免疫分型选择表达较高者,其中11例AML均高表达CD33（＞20%）,3例ALL均高表达CD19（＞70%）。其余无治疗后缓解配对的20例患者和20例健康对照者单独检测细胞端粒长度。同时应用RQ-PCR方法检测同一批标本的端粒长度,与FLOW-FISH方法进行对照。比较白血病患者与健康对照者端粒长度的差异;初步分析端粒长度与白血病临床特征、预后的关系;追踪部分病例,观察不同病程中端粒长度与表面分化抗原的变化情况。4.应用SPSS13.0软件统计分析数据。两组计量资料间分布比较用Mann-Whitney U test;配对计量资料间分布比较用Wilcoxon signed rank test;两组以上计量资料间分布比较用Kruskal-Wallis test;两变量间相关分析采用Spearman rank correlation analysis;率的比较采用x² test。检验水准α=0.05,双侧检验。结果:1.利用不同细胞株建立了较稳定可靠的FLOW-FISH检测细胞端粒长度的实验方法,同时成功建立了FLOW-FISH检测细胞端粒长度的同时应用流式细胞仪检测表面分化抗原的实验方法。2.24例急性白细胞患者端粒相对平均荧光强度（代表相对端粒长度RTL）中位数为0.240,2例CLL患者为0.235,3例CML-BP患者为0.249,5例CML-CP患者为0.435,20例健康对照者为0.408。各组间存在显著差异（x²=18.403,P=0.001）,其中急性白血病、CLL及CML-BP组患者较健康对照者端粒显著缩短,而CML-CP组患者与健康对照者相比,端粒长度处于相同水平。14例化疗后获完全缓解（CR）的急性白血病患者CR后端粒显著延长（Z=-3.233,P=0.001）,而CR后端粒长度与健康对照者相比,差异无统计学意义（U=114.0,P=0.363）。FLOW-FISH检测的端粒相对平均荧光强度（RTL）与RQ-PCR检测的端粒T/S比值（亦代表端粒长度）显著相关（r_s=0.860,P=0.000）。3.20例健康对照者中,端粒长度随年龄增长而缩短（r_s=-0.671,P=0.001）,年龄无显著差异女性较男性端粒长（U=22.0,P=0.037）。而在34例初发白血病患者中,端粒长度与年龄、性别不相关。24例急性白血病患者中,端粒长度与外周血白细胞计数存在负相关关系（r_s=-0.597,P=0.002）,与血红蛋白含量、血小板计数无明显相关性。在可随访的23例急性白血病患者中,端粒长度大于中位数者初治CR率为81.82%,小于中位数者为58.23%。5例CML-CP患者均服用STI571治疗,其中2例端粒长度较短者（RTL 0.254～0.232）半年内急变,另3例端粒长度处于正常水平者（RTL 0.435～0.598）3个月内获CHR,6个月获CCyR,随访10个月内未发生急变。4.14例联合检测表面分化抗原的初发急性白血病患者,抗原表达率与常规免疫分型结果一致,CR后均表达下降。5例动态联合检测的患者中,2例长期CR者在缓解后端粒长度恢复,在缓解期始终处于正常水平,且无特异抗原表达增高。3例复发者均表现为在起病时端粒显著缩短,CR后较前延长,复发后再次缩短,同时特异抗原表达增高,其中2例患者相关抗原阳性细胞群端粒的缩短先于整个细胞群端粒长度的变化,先于骨髓细胞形态学改变。结论:1.建立了FLOW-FISH及RQ-PCR(2^-ΔΔCT法)两种检测细胞端粒长度的实验方法。2.建立了FLOW-FISH检测细胞端粒长度的同时应用流式细胞仪检测表面分化抗原的实验方法。3.34例初发白血病患者中,除CML-CP患者,其余端粒长度均较同年龄健康对照组显著缩短。其中14例化疗CR后急性白血病患者端粒长度恢复。FLOW-FISH及RQ-PCR两种方法结论一致,且相关性良好。4.20例健康对照者中,端粒长度随年龄增长而缩短,女性较男性端粒长。而在初发白血病患者中,端粒长度与年龄、性别不相关,与外周血白细胞计数成负相关。在可随访的23例急性白血病患者中,端粒长度大于中位数者初治CR率较高。5例CML-CP患者端粒长度较短者易早期发生急变。端粒长度是区分造血细胞正常与恶性克隆,监测疾病状态、评估预后的有意义的指标,并且在各类白血病中具有较普遍意义。5.FLOW-FISH联合检测细胞端粒长度和表面分化抗原更有利于白血病的动态全面监测,有望更早发现异常克隆或克隆演变,可能可以作为监测白血病MRD的可广泛应用的新方法。