菲律宾蛤仔C型凝集素免疫功能及分子识别机制的研究

来源 :大连海洋大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:lengningyan
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C型凝集素作为凝集素家族中的主要成员之一,在识别外来微生物表面的碳水化合物基团和激活体液中免疫因子等方面具有重要作用。本论文中采用分子生物学、生物信息学和免疫学等多种技术,对菲律宾蛤仔C型凝集素RpCTL进行了结构和功能的研究,以及LPS注射、低温因子胁迫对C型凝集素的影响,探讨其在菲律宾蛤仔免疫系统中的作用。利用生物学分析6个菲律宾蛤仔C型凝集素基因(CTL-1、CTL-2、CTL-3、CTL-4、CTL-5和CTL-6),并检测其在健康蛤仔的不同组织中表达分布和低温胁迫下的蛤仔的肝胰腺中的时空表达模式进行分析。结果表明,6个C型凝集素基因开放阅读框长度分别为588bp、408bp、462bp、1017bp、840bp和471bp,且预测分子量范围为15.47-39.28kDa,PI在4.33-6.17之间,推测出这些序列由4-6个外显子、3-6个内含子组成。蛋白质二级结构预测得出这些C型凝集素由3-9个α螺旋、3-9个β链、3-8个线圈组成。对结构域进行预测后发现,除CTL-2和CTL-3外,在CTL-1、CTL-4、CTL-5和CTL-6中鉴定出了信号肽。另外,这些凝集素开放阅读框中均仅具有一个单一的CRD,其中4个完全保守半胱氨酸残基和参与CRD内二硫化物形成的和两个Ca2+依赖的碳水化合物结合基序EPN和WND也在结构中发现。采用qRT-PCR技术检测了健康菲律宾蛤仔C型凝集素基因在不同组织器官中的表达情况,结果表明6个C型凝集素基因均在鳃和肝胰腺中显著表达,并且在低温胁迫后菲律宾蛤仔的肝胰腺中C型凝集素基因在不同的时间点均有1到2个时间点的显著诱导,说明低温诱导了菲律宾蛤仔C型凝集素基因的表达。从6个C型凝集素基因中利用RACE技术从菲律宾蛤仔中克隆获得了中的CTL-1(RpCTL)基因的cDNA序列全长(GeneBank登录号:MH36885),RpCTL全长为802 bp,由三部分组成:5’UTR:58bp,3’UTR:153bp,和开放阅读框为591bp。其开放阅读框编码的蛋白中含有一个CTL结构域,编码196个氨基酸,其PI为5.19,预测分子量为22.36kDa。推测RpCTL的氨基酸序列具有16个氨基酸残基的信号肽以及参与结构域内部二硫键形成的完全保守的四个半胱氨酸残基(Cys30-Cys104,Cys124-Cys132)和两个Ca2+依赖的碳水化合物识别位点EPN(Glu 94-Pro 95-Asn 96)和WND(Trp 119-Asn 120 Asp 121)。通过RpCTL与其他脊椎和无脊椎动物C型凝集素序列做进化分析发现,RpCTL氨基酸序列首先与牡蛎聚为一支,然后与海湾扇贝、皱纹盘鲍和文蛤等软体动物聚为一支。然而其他脊椎动物如鱼类、哺乳动物、两栖动物和鸟类C型凝集素形成一簇。其他节肢动物聚为一支。利用RT-qPCR检测RpCTL的mRNA在菲律宾蛤仔2个群体(北方养殖群体和野生群体)和3种品系(斑马蛤、白蛤和白斑马蛤)的外套膜、鳃、水管、闭壳肌、足和肝胰腺组织中的表达分布。结果显示:RpCTL的mRNA广泛表达于不同群体的所有组织中。在养殖群体中,水管、鳃和肝胰腺的表达量分别是足部的4.38倍、7.44倍和11.52倍(P<0.05)。野生群体中,水管、鳃和肝胰腺的RpCTL表达量分别为3.89、4.16和49.00倍(P<0.05)。在白蛤中,RpCTL在外套膜、鳃、水管和肝胰腺中高表达,分别是足的5.70倍、12倍、3.21倍和40.72倍(P<0.05),而闭壳肌和足的表达水平相对较低。在白斑马蛤中,RpCTL在鳃、水管和肝胰腺中高表达,分别为足的3.79倍、6.83倍和13.67倍(P<0.05)。斑马蛤外套膜、闭壳肌和足的表达水平相对较低,而在鳃和肝胰腺中表达量较高,分别是足的4.68和17.64倍(P<0.05)。综上所述,RpCTL的mRNA主要分布在菲律宾蛤仔鳃和肝胰腺中。并且在LPS注射后RpCTL的mRNA在不同群体的菲律宾蛤仔的鳃和肝胰腺中,在不同时间点均有显著表达,说明LPS诱导了菲律宾蛤仔RpCTL基因的表达。利用原核重组表达及纯化方法诱导出RpCTL蛋白,大小为23 kDa,利用不同浓度的咪唑(20、50、80、100、150、200和300 mM)通过亲和层析方法纯化融合蛋白,SDS-PAGE检测结果表明:RpCTL在80、100和150 mM咪唑浓度下能纯化出较高的浓度,其中在咪唑浓度为100 mM时获得RpCTL蛋白的浓度最大。通过抑菌圈实验发现重组RpCTL对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和鳗弧菌的生长具有不同程度的抑制作用。且在终浓度为20、60或180μg/ml的RpCTL对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的生长抑制曲线实验结果发现,终浓度为20和60μg/ml的RpCTL对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌细胞生长的抑制作用弱于180μg/ml的RpCTL。在鳗弧菌感染后的菲律宾蛤仔注射重组RpCTL的存活率测试中,注射RpCTL+鳗弧菌组的存活率高于鳗弧菌+PBS组,但低于PBS+PBS组合和PBS+RpCTL组。综上所述得出重组RpCTL对微生物生长具有一定程度的抑制作用,且对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和鳗弧菌的细胞增殖具有明显的抑制作用。
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