论文部分内容阅读
毛色生成调控机制的研究既可以帮助我们进一步了解哺乳动物生物学特征的发生机制,又可以促进天然毛色在毛用产品工业的应用,避免由于染色对人们健康的危害,具有重要的研究意义。microRNA (miRNA)通过与其靶基因的3’UTR端的结合位点相结合,抑制或降解靶基因的表达,从而参与多种生物学过程的调控。在之前的研究中,我们成功地构建了包括灰色和棕色毛色表型在内的microRNA-137 (miR-137)转基因小鼠,并发现在不同毛色转基因小鼠的皮肤中,miR-137的表达量差异显著。然而,miR-137导致转基因小鼠发生毛色表型变化的毛色生成调控机制仍尚未研究。为了进一步研究miR-137的毛色生成调控机制,本文通过对灰色、棕色miR-137转基因小鼠背部皮肤进行转录组测序,发现miR-137不同程度过表达导致小鼠毛色变化的过程中所调控的基因以及基因功能、影响的信号通路和生物学过程；利用对小鼠皮肤组织的HE染色和免疫荧光实验验证了上述信息学分析所提出的miR-137可以影响黑色素细胞内黑色素合成过程这一假设；通过生物信息学预测和双荧光报告实验验证,寻找miR-137导致小鼠毛色变化的过程中直接调控的毛色相关靶基因,同时在小鼠皮肤黑色素细胞中过表达miR-137,观察其靶基因和靶基因毛色通路中下游基因的表达变化以及黑色素生成量的变化,揭示了miR-137调控毛色生成的作用机制。1.以灰色、棕色miR-137转基因小鼠皮肤作为实验材料,通过转录组测序技术,检测到两种毛色小鼠皮肤中表达的基因约19,000个。利用这些基因在不同毛色小鼠皮肤中的表达量差异,我们筛选出93个表达量差异程度在2倍以上且符合统计学意义(0.8≤Diverse probability≤1)的表达量显著差异的基因(差异基因)。为了验证转录组测序结果,我们通过荧光定量实验对差异基因在灰色、棕色转基因小鼠皮肤中的相对表达量进行实验验证,结果显示所选基因的表达量趋势与测序结果一致,这证明了此次转录组测序数据的可靠性,同时为进一步对表达基因为基础的后续分析奠定了重要的基础。2.为了进一步了解miR-137调控两种毛色小鼠表型产生的过程中所影响的基因功能和信号通路,我们首先利用Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships (PANTHER)软件对所有差异基因的基因功能进行Go Ontology (GO)功能注释并观察差异基因在GO功能中的宏观分布。继而,通过Database for Annotation, Visualizationand Integrated Discovery (DAVID)软件,对已经注释GO功能的差异基因进行GO功能富集,结果发现差异基因显著富集于黑色素合成功能。然后,我们将差异基因富集到Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)数据库中的信号通路中,发现差异基因显著富集于黑色素合成这一通路。从而分析出,miR-137在黑色素细胞内的黑色素合成过程中起到关键的调控作用,导致了不同毛色小鼠表型的产生。3.为了进一步探究miR-137在小鼠体内过表达后从整体水平上调控小鼠体内的生物学过程变化,我们通过GSEA分析手段,分析灰色、棕色小鼠皮肤转录组测序得到的全部表达基因所共同富集的生物学过程。为了保证分析的准确性,我们选择GSEA数据库中收录的已验证基因功能的Hallmark基因集对转录组获得的全部表达基因进行生物学过程富集分析。同时,为了进一步验证上一章中我们对所选差异基因进行功能富集分析结果的准确性,我们在选取Hallmark基因集的同时也选取GO gene sets基因集进行GSEA分析。从分析结果中我们发现,miR-137在棕色小鼠体内过表达确实引起了黑色素合成的变化,这与上一章所分析的结果一致,并发现miR-137不同程度的表达趋势可以引起小鼠体内不同生物学过程的变化：在灰色小鼠表型中,miR-137通过调控Myc下游基因和参与核糖体相关过程可以调控色素沉着更显著的变化。4.在灰色、棕色小鼠体内表达量差异的基因中对miR-137的靶基因进行生物学预测,并找出可能导致毛色直接变化的靶基因Kit和Myo7a 。结合第二、三章的分析结果中,miR-137在黑色素合成过程中影响了黑色素生成量的变化导致了棕色小鼠表型产生,从而得知miR-137可能通过影响SCF/Kit通路及下游黑色素合成相关基因而导致了棕色毛色小鼠表型的产生。5.利用HE染色和免疫荧光实验,发现miR-137在转基因小鼠过表达引起了黑色素细胞中黑色素生成量的改变。鉴于此,通过双荧光报告实验验证了Kit是miR-137的靶基因,并发现miR-137在小鼠黑色素细胞中过表达可以引起Kit及其下游基因Tyr, Tyrp1和Dct (Tyrp2)的表达量发生变化,调控小鼠皮肤黑色素细胞中黑色素含量的生成。结论： (1)miR-137主要通过影响黑色素细胞中黑色素合成过程导致转基因小鼠浅色表型产生。 (2)miR-137产生灰色、棕色两种转基因小鼠表型的作用机制是不同的。miR-137通过直接影响黑色素细胞中黑色素合成过程导致棕色小鼠表型产生,并且miR-137通过调控Myc下游基因及核糖体相关过程,导致更明显的灰色小鼠表型产生。(3)Kit和Myo7a是miR-137导致转基因小鼠毛色表型变化过程中直接调控的毛色相关靶基因。 (4)通过实验验证了上述分析提出的miR-137过表达影响黑色素细胞中黑色素合成过程这一作用机制的假设以及Kit与miR-137之间的靶向关系,并发现miR-137通过影响SCF/Kit通路中Kit及Kit下游参与黑色素合成过程的主效基因Tvr.Tyrp1和Dct (Tyrp2)的表达抑制黑色素细胞中黑色素的生成。