肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae)是一种革兰氏阴性菌,在自然界中分布广泛,能够引起人类和动物的肺炎、尿路感染、细菌性脑膜炎和败血症,以及多种呼吸道和胃肠道疾病,是重要的人兽共患病病原体。尤其是近年来,肺炎克雷伯菌(简称为肺克菌)被认定为是一类严重的多药物耐药菌,同时因为其在全球范围内传播,从而引发了重大的公共卫生问题,对人类和动物的身体健康和生命安全造成了巨大威胁。肺克菌的耐药情况目前非常严重。该菌是碳青霉烯类抗生素耐药菌感染的主要病原体之一,同时对第三代头孢菌素类药物耐药严重,可以说对于该菌的治疗已经近乎面临无药可用的地步。肺克菌是一类分布广泛、致病谱广的机会致病菌,鉴于其在临床上的耐药情况异常严峻,探究肺克菌耐药机制,为临床治疗肺克菌感染开辟新的途径具有重要意义。Hfq蛋白是细菌基因表达重要的转录后调控因子,它能介导s RNA与m RNA之间的相互作用,影响m RNA的稳定性,促进或阻碍m RNA翻译。这种基因调控机制对细菌是至关重要的,能够影响细菌多种细胞过程和生理生化反应,尤其是对宿主菌的生长、代谢及毒力等方面都具有重要调控作用。Hfq蛋白对肺克菌基因表达有全局性影响,本实验探究该蛋白对肺克菌耐药性影响及其调控机制无疑对更加深入理解肺克菌耐药性的形成过程具有重要意义,同时也可能为研究开发防治肺克菌感染性疾病的药物提供新的思路。本实验中首先利用基于Red-重组系统方法将hfq基因敲除,构建肺克菌hfq突变株。然后通过药物敏感性试验,考察肺克菌野生株和hfq突变株药物敏感性的差异,说明hfq对肺克菌耐药性的影响。Δhfq株对头孢菌素类药物、美罗培南、左氧氟沙星、替加环素、阿奇霉素、吗啉噁酮的耐药性均比野生株耐药性有所上升,对多肽类药物和利福平的药物敏感性与野生株一致,而对氨基糖苷类药物的药物敏感性有所下降。研究中同时构建了Δhfq回复株,其耐药性和野生株基本一致。本研究选择了头孢菌素类药物进行时间-杀菌曲线试验,说明Δhfq株在更高浓度的头孢菌素类药物下的存活能力远远强于野生株的存活能力,进一步证明了hfq的突变会导致肺克菌对头孢菌素类药物耐药性的增强。鉴于Hfq是全局性调控因子,本实验考察了与肺克菌耐药性密切相关的外排泵基因acr B和oqx B及其调控因子ram A、mar A、sox S,主要外膜孔道蛋白Omp35、Omp36在野生株和Δhfq株中的表达情况,同时还用结晶紫染色定量法检测了野生株和Δhfq株形成生物被膜的能力。结果表明,相对野生株,acr B、oqx B、sox S和mar A表达量均有所升高,外膜蛋白Omp35基因表达量下降而Omp36基因表达量有所上升,同时Δhfq株生物被膜的形成能力显著增强。鉴于对头孢菌素类药物耐药性变化较大,本实验还利用荧光定量PCR的方法分析了青霉素结合蛋白在Δhfq株和野生株中的表达情况。结果发现肺克菌中主要的9种PBPs,除了PBP4的表达量略有上升外,其余8种PBPs的表达量均有所下降,尤其是PBP6b和PBP7,下降具有显著的统计学差异(p<0.05),说明这两种PBPs受到Hfq蛋白的调控作用较强,暗示他们参与了Hfq蛋白对头孢菌素类药物耐药性的调控。细菌中Hfq蛋白对基因的调控作用主要是透过介导s RNA和m RNA之间的相互作用来实现的。对肺克菌s RNA进行研究,发现新的s RNA或者s RNA新的功能,将在新的层次中对Hfq蛋白调控肺克菌耐药机制有更进一步的理解,同时也有望为肺克菌疾病药物的研发提供新的思路。本研究利用生物信息学方法,在肺克菌中共预测出了59条候选s RNA序列。通过PCR和RT-PCR的方法,验证出32个候选s RNA。为了进一步确定这些候选s RNA中哪些与肺克菌耐药性相关,本实验研究利用半定量比较分析的方法考察这些候选s RNA在不同抗生素处理条件下的转录本丰度,从而发现与肺炎克雷伯菌耐药性相关的s RNA。头孢菌素和氨基糖苷类抗生素联用是目前临床上治疗肺克菌感染的常见用药方案。尽管hfq突变株对头孢菌素耐药性升高,但对氨基糖苷类药物耐药性却有所降低。还有,肺克菌生物被膜对氨基糖苷类抗生素的耐药程度与悬浮菌相同,说明降低这类抗生素的用药浓度会有效降低治疗生物被膜产生感染的用药剂量。同时,肺克菌hfq突变株的毒力和侵袭力大幅减弱,因此,Hfq蛋白抑制剂与氨基糖苷类药物的联合使用有望成为临床治疗肺克菌感染的有效策略。本研究利用以结构为基础的药物设计方法,通过同源模建、活性位点预测及分子对接的方法在小分子化合物的类药性化合物库中对肺克菌Hfq抑制剂进行筛选。依据小分子配体和受体蛋白的结合能以及ADMET检测结果,筛选得到10个具有Hfq抑制活性的候选分子。其中ZINC25147445具有最低结合能为-11.4kcal/mol。通过Autodock软件进行分子对接以考察具有最低结合能的三个小分子ZINC25147445、ZINC35363745和ZINC20859128抑制Hfq蛋白的分子机制。结果显示小分子配体和Hfq蛋白之间存在着疏水作用力、氢键和π-π堆积力。其中Hfq蛋白上的GLN8,GLN41,PHE42,TYR55,LYS56和HIS57是主要的结合位点。综上所述,Hfq对肺克菌耐药性具有重要影响。这种影响是Hfq通过调控肺克菌外排泵表达、外膜孔道蛋白表达、生物被膜形成以及药物靶标表达来实现的,是多种机制共同作用的结果。本实验利用生物信息学和实验验证相结合的方法发现肺克菌内可能存在的与肺克菌耐药相关的s RNA,Hfq对肺克菌耐药性的调控是否通过这些s RNA来实现是下一步研究的重点方向。此外,本实验还依靠计算机手段虚拟筛选出一批Hfq潜在抑制剂,期望为研发防治肺克菌感染药物开辟新思路。这些发现与研究为进一步阐明肺克菌耐药机理提供基础,同时为临床研发抗肺克菌感染药物提供了新的策略。