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背景国内外科学界经过二十五年的不懈努力,在艾滋病致病机制、抗病毒治疗等方面取得了较大进展,但迄今为止人们对HIV病毒感染的免疫保护机制及影响HIV感染者疾病进程的确切因素尚缺乏本质上的认识,这是艾滋病疫苗研制和免疫治疗面临的重大挑战。如不进行抗病毒治疗,绝大多数HIV-1感染者的免疫功能将呈进行性下降,后期可出现整体免疫系统的崩溃现象,最终不能控制机会性感染而导致患者死亡。虽然目前的研究证据提示以特异性细胞毒T淋巴细胞作用(CTL)为主的细胞免疫在控制艾滋病毒感染过程中具有重要作用,但细胞免疫的确切保护机制尚不清楚。目前有关HIV特异性T细胞免疫应答的研究以T细胞功能及T细胞频数为主,直接针对在免疫系统中起重要作用的T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)改变的研究较少,而TCR多样性的改变或紊乱可能与免疫功能缺陷密切相关。目的本研究应用TCR CDR3免疫谱型分析技术对正常人及HIV感染者的CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的22个Vβ基因家族(无免疫功能的Vβ10和Vβ19未分析)的多样性进行定量分析,以综合评价HIV感染者细胞免疫的状况,探索HIV-1感染者TCR多样性的变化特点及其与病毒复制的相关性。并通过分析CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞TCR的变化,初步探讨HIV感染导致的辅助T淋巴细胞(T helper cell,Th)与细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)TCR谱系损害程度及其差异。方法以Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从EDTA抗凝全血分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。用dynal磁珠分离CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞。分别从分离的CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞提取总RNA,逆转录后利用各BV家族特异性引物,进行巢氏多聚酶链式扩增(Polymerase Chain Reaction,PCR),PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析,初步了解各BV家族表达情况。然后将标有6-FAM荧光素的PCR产物在中国疾病预防控制中心2009年硕士学位论文6%聚丙烯酰胺变性测序胶上电泳并应用GeneScan软件扫描记录相关信息并进行数据分析,获得T细胞TCR CDR3区多态性和长度分布,从而判断每个BV家族CDR3谱型的漂移情况及单/寡克隆性增生情况。利用SigmaPlot和SPSS等统计软件分析不同疾病进展者TCR CDR3谱系的变化及其与病毒载量的相关性。结果(1)正常人T淋巴细胞中TCR 22个BV家族CDR3谱型呈高斯(Gaussiandistribution)分布。(2)HIV-1感染者CD8+T细胞的TCR基因多态性明显减少(P＜0.05),部分TCR Vβ基因家族CDR3区的高斯分布破坏;TCR的紊乱与病毒载量呈正相关(R=0.640,P=0.008):TP组的TCR多样性紊乱程度大于LTNP组;病毒载量小于2000组(Viremic controllers)的TCR多样性紊乱程度小于病毒载量大于10000组(Noncontrollers);TP组Vβ2,Vβ3,Vβ4,Vβ5,Vβ6,Vβ9,Vβ11,Vβ12,Vβ13,Vβ15,Vβ17,Vβ21,Vβ22,Vβ23基因家族的变化均与正常组有统计学差异,LTNP组Vβ3,Vβ5,Vβ6,Vβ11,Vβ14,Vβ23基因家族的变化与正常组存在统计学差异。TP组与LTNP组之间Vβ2,Vβ21有统计学差异。(3)HIV-1感染者CD4+T细胞的TCR基因多态性明显减少(P＜0.05),部分TCR Vβ基因家族CDR3区的高斯分布破坏;TCR的紊乱与病毒载量呈正相关(R=0.676,P=0.003);TP组的TCR多样性紊乱程度大于LTNP组,但正常组与LTNP组间无显著性差异;病毒载量小于2000组(Viremic controllers)的TCR多样性紊乱程度小于病毒载量大于10000组(Noncontrollers);TP组Vβ8,Vβ12,Vβ22,Vβ23基因家族的变化与正常组存在统计学差异,LTNP组Vβ12,Vβ22,Vβ23基因家族的变化与正常组存在统计学差异。TP组与LTNP组之间Vβ1,Vβ8,Vβ12,Vβ13有统计学差异。(4)特异性CTL反应强度和广度与CD8+T细胞TCR紊乱程度呈正相关的趋势,与CD4+T细胞TCR紊乱程度呈负相关的趋势。(5)HIV感染者CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞TCR谱系偏移的程度不同,CD8+T淋巴细胞的TCR谱系紊乱程度大于CD4+T淋巴细胞。结论(1)HIV-1感染者CD8+T细胞和CD4+T细胞TCR CDR3区的谱系均出现紊乱,表现为基因多样性的减少及高斯分布的破坏。(2)TCR CDR3区的紊乱与病毒载量呈正相关,病毒复制控制较好、疾病进展缓慢(LTNP)者的TCR中国疾病预防控制中心2009年硕士学位论文多样性紊乱程度较小,提示TCR CDR3的谱系变化对于评价HIV感染者的免疫功能状态和疾病进程具有一定意义。(3)HIV感染过程中CD4+T细胞TCR谱系的完整稳定对机体维持特异性CTL反应强度和广度有重要作用,CD4+T细胞TCR谱系保持的越完整,CD8+T细胞针对特异抗原反应的强度和广度越大。(4)HIV感染者CD8+T细胞TCR谱系紊乱程度显著大于CD4+T细胞。