脑心肌炎(EMC)是由脑心肌炎病毒(EMCV)引起的一种以脑炎、心肌炎和繁殖障碍为主要临诊特征的人畜共患传染病。自然条件下,鼠类是其自然贮存宿主和传播者,感染最广泛和受危害最严重的动物是猪,人感染发病也时有发生。国内于2005年成功分离到首株病毒,现已证实猪群中感染极为普遍,但抗体阳性率差异显著。尽管尚未发生严重疫情,但其威胁日趋严重。河南省地处中原,为养殖大省,加之地理环境复杂,生物多样性丰富,啮齿类动物种类繁多、活动频繁,为EMCV的发生、传播和流行提供了客观条件,但迄今为止,关于本病在河南省的流行病学情况、病原学特征、诊断及防控技术等各项研究均为空白。本文通过对6株不同动物源EMCV河南地方流行株进行分离鉴定、全基因组测序解析、诊断方法建立、致病性试验、基因表达和联合疫苗研究,以期丰富我国EMC的基础理论和临床应用研究,将该病潜在的严重威胁降至最低。1.不同动物源EMCV河南流行株的分离、鉴定及全基因组测序解析为研究EMCV对不同动物的感染情况,本文应用“细胞接种与RT-PCR相结合”方法,成功分离到国内首株地方土猪源、首株家养野猪源、3株良种猪源和1株鼠源EMCV。由此证实EMCV已在河南省猪场中存在;EMCV可引起不同动物感染,提醒在进行地方品种养殖和野生动物家养时要充分考虑人兽共患疫病传播的生态学。6株分离毒的基因组序列全长7 724 bp~7 735 bp不等,彼此间高度同源,与国内猪源、鼠源分离毒处于同一分支。各基因片段中,以VP1和2A变异幅度最大,VP2和3D最为保守。系统进化树显示,EMCV可分为G1、G2和G3 3个群。6株分离毒与国内其他参考毒同属于G1群,但分布并不完全集中,对鼠均具有高致病性。推测鼠是不同猪种之间EMCV交叉感染、传播与流行的重要媒介。不同的EMCV地方流行株间存在较大的地域差异,其传播具有一定的区域限制性。2.EMCV诊断方法的研究建立快速、特异和敏感的检测方法对本病的诊断、流行病学调查、病原学研究及疫苗研发等至关重要。本文以地方土猪源EMCV HNXX13的VP1基因为靶序列,建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,特异性强,重复性良好,灵敏度高,可为EMCV的分子流行病学调查、疫情监测、病原学研究和快速诊断等提供技术平台。对家养野猪源EMCV JZ1202的VP1基因进行原核表达和鉴定,并以该重组蛋白作为包被抗原,建立了检测血清抗体的间接ELISA方法。临床初步应用结果表明,受检的河南省部分猪场阳性场检出率为65.87%,血清总阳性率为45.30%。不同规模和不同阶段猪群均存在EMCV感染,中小型猪场的阳性率显著高于规模化猪场。EMCV与猪圆环病毒2型(PCV-2)的混合感染率高达75.14%。本研究填补了河南省EMCV分子流行病学和血清流行病学监测的空白。3.PCV-2所致免疫抑制条件下继发感染EMCV对仔猪的影响研究了PCV-2所致免疫抑制条件下继发感染EMCV对仔猪生长和致病性的影响。发现PCV-2先期感染可使EMCV对仔猪表现出更为严重的致病性和致死性。仔猪相继感染PCV-2和EMCV后,淋巴细胞比率及EMCV中和抗体较长时间维持在低水平。研究结果表明,EMCV单独感染组后第1 d到第9 d可从猪肛门拭子检测、分离到病毒,而相继感染组的排毒期则可持续至感染后第12 d,提示先感染PCV-2可延长EMCV感染猪的排毒期。4.EMCV/PCV-2二联灭活疫苗的研制和免疫效力测定国外已成功研制出EMC灭活疫苗,与其他疾病的联合疫苗的研究尚未见报道。本文研制出EMCV/PCV-2二联灭活疫苗,接种小鼠和仔猪后发现,免疫效果均高于相应单苗,并可产生各自的高水平抗体,可完全有效抵抗EMCV和PCV-2强毒株的攻击,为2种疾病的联合免疫提供了可能,达到“一针防两病”的效果,满足了EMCV免疫的潜在需求。5.EMCV VP1基因在杆状病毒中的表达及其免疫原性研究应用昆虫杆状病毒表达EMCV国内流行株VP1基因的相关研究极少。本文根据杆状病毒密码子的偏嗜性,对EMCV河南流行毒JZ1201的VP1基因进行优化和人工合成,利用杆状病毒表达系统获得可稳定表达VP1蛋白的重组杆状病毒。免疫小鼠后能产生针对EMCV的高水平特异性中和抗体,且明显高于EMCV全病毒灭活苗,并可明显提高淋巴细胞的分裂、增殖能力,免疫原性良好,为进一步研究其功能以及亚单位疫苗、诊断抗原的研发奠定基础。综上所述,本文为研究我国EMCV的流行病学监测体系、致病机理、快速诊断、免疫机理以及新型疫苗研制等奠定坚实基础,从而为有效防控该病提供科学理论依据。