肝癌被誉为“癌中之王”,是最常见的恶性肿瘤之一。中国每年新发肝癌患者约占全球一半以上,死亡率在所有恶性肿瘤中位列第二位,严重威胁人民的生命和健康。肝癌起病非常隐匿,早期无明显症状。约80%的肝癌患者首诊就已进入中晚期,5年生存率几乎为零,而早期肝癌患者经过治疗,5年生存率可达60%以上。因此,早诊早治是对抗肝癌的重要手段。甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)作为一种血清标志物,是诊断肝癌的常用指标。然而,AFP检测的灵敏度较低,仅有60%～70%的早期肝癌患者AFP值呈阳性。同时,常规的影像学检查,如B超和CT难以发现肿瘤直径小于2 cm或密度近似肝实质的早期肝癌。因此,早期肝癌诊断仍面临较高的假阴性率及漏诊率。随着科学的发展和进步,以液体活检(Liquid biopsy)这种侵入式小、灵敏度高的肿瘤诊断技术应运而生。其中,循环miRNA分子标志物检测已被写入2019版《原发性肝癌诊疗规范》,并被纳入肝癌早期检测和诊断临床应用。然而,miRNA是一类长度较短的RNA单链分子,且学术界尚未确定一种合适的miRNA内源性参照基因,极大地影响了其定量结果的准确性,也是一直限制miRNA标志物在肝癌早期诊断中广泛应用的重要因素。近年来,随着等温扩增技术的快速发展,其在核酸分子检测效率和灵敏度方面展现出较大优势,特别适合miRNA类小分子的检测。同时,微流控芯片技术的兴起,极大地推动着以数字核酸扩增检测(Digital nucleic acid detection,dNAD)技术为代表的“第三代”基因扩增技术的发展。借助于高通量微流控芯片微纳米级反应单元,可以实现单分子独立分割和有效扩增,且无需借助内参基因的标定,实现基因的绝对定量。因此,本研究充分利用miRNA分子标志物可以作为肝癌早期诊断的学术共识,开展微流控数字等温扩增技术研究及其在肝癌miRNA检测中的应用,主要内容如下:基于链置换扩增技术(Strand displacement amplification,SDA)原理出发,结合miRNA分子的特殊结构,创新性地设计了一系列荧光自抑制探针,并以此建立了一种无背景荧光探针链置换指数扩增(BF-ESDA)检测系统,该方案能够有效地提高低浓度miRNA的检测信噪比,特别适合临床样本中痕量miRNA分子的检测。在90分钟内,可以实现9个数量级的动态检测范围,检测限可达0.08 aM。另外,基于微流控芯片技术,设计并制备了一种自吸分液式高通量微流控芯片。该款芯片可根据目标分子的浓度差异,同时满足1个、2个、4个甚至8个独立样本的检测需求,整个进样和油封过程仅需2～3分钟。通过防蒸发密封、分液均一性、油液稳定性,和生物兼容性等一系列试验,确认该款芯片能够满足数字等温扩增检测需要,是实现miRNA分子绝对定量的有效载体。为了丰富肝癌miRNA分子标志物数据库,通过数据库和生物信息学分析,临床样本试验,发现并鉴定3个miRNAs(hsa-miR-185、hsa-miR-4311和hsa-miR-1255b)在肝癌患者和健康受试者血清中的表达差异极显著(P＜0.01)。同时,还确认hsa-miR-4644在表达丰度和稳定性方面均优于目前已知的miRNA内参基因。为了建立一套肝癌早期预警模型,提高肝癌患者的检出率和生存率。联合本研究发现的hsa-miR-185、hsa-miR-4311、hsa-miR-1255b和文献中报道的miR-21、miR-26a、miR-192、miR-143分子标志物,以及AFP血清标志物进行Logistic回归分析,采用ROC曲线评价它们在肝癌早期诊断中的效能。结果表明,以这7个miRNA和AFP组成的诊断模型,当满足一定条件时,判断受试者是否患有肝癌的敏感度可达95.24%,特异度可达80.95%。经临床样本验证,发现其误诊率仅为7.14%。因此,该诊断模型可以有效地发现并诊断早期肝癌。综上所述,以新型无背景荧光探针链置换等温扩增技术为检测方法;以自吸分液式高通量微流控芯片为检测载体;以miRNA分子标志物为检测目标,开展了用于肝癌miRNA分子标志物绝对定量的数字等温扩增技术研究,并最终建立了一套肝癌早期诊断预警模型,为提高肝癌患者的检出率和生存率提供了一种有效的解决方案。