人参花药、杂种胚培养及基于皂苷含量的特性评价

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人参(Panax ginseng C.A. Mey)是五加科人参属多年生草本药用植物。在我国,人参育种工作虽然起步较早,但发展缓慢。育种周期长、变异类型不稳定、混杂程度高是影响其发展的主要瓶颈。为此,结合物种特性,选用适当的育种方法获得丰富、稳定的遗传类型,加快育种进程是开展人参育种工作的当务之急。本研究运用花药单倍体培养、远缘杂交胚培养、流式细胞术、蛋白质组学和超高液相等方法对人参花药愈伤组织诱导及植株再生技术、杂种幼胚培养技术、人参花药超低温保存技术及皂苷含量特性评价等进行研究,主要研究结果如下:1.人参花药单倍体培养研究结果表明:花粉小孢子发育处于单核中期时,愈伤组织诱导率最高;最佳愈伤组织诱导培养基为MS+2,4-D1.5mg/L+KT0.5mg/L+蔗糖6%+琼脂0.6%;最佳分化培养基为MS+TDZ3mg/L+IBA0.2mg/L+GA2mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%;不同年生、不同品种间人参花药愈伤组织成愈率不同,四、五年生大马牙人参显著高于三年生者;黄果人参显著高于大马牙、二马牙等品种。2.人参×西洋参及父母本幼胚培养研究结果表明:幼胚发育时期、品种和培养基等都直接影响着幼胚萌发率。母本人参及杂交种幼胚均以授粉36-45d后接种,萌发率高;父本西洋参幼胚以授粉45-54d后接种,萌发率最高;四年生二马牙人参幼胚在各个发育时期的萌发率(2.3%-38.9%)均高于四年生大马牙者(1.29%-15.6%);不同杂交组合中,四年生二马牙×四年生西洋参幼胚萌发率最高(33.7%);接种在MS+BA1mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%培养基上的杂种幼胚(四年生二马牙×四年生西洋参)萌发率最高。3.人参花药愈伤组织和花药苗的倍性鉴定结果表明:品种、培养基和继代次数都直接影响着人参花药愈伤组织的倍性。不同品种对同一培养基的培养反应不同,其倍性没有明显规律;继代第1-2次是其倍性变异的高峰期,继代5次以后,变异基本趋于稳定;愈伤组织成苗后,倍性受培养条件的影响较小,变异率低。4.人参花药愈伤组织超低温保存方法的研究结果表明:最佳人参花药愈伤组织超低温保存方法是:先将材料在4℃低温下预处理14d,再加入含有5%DMSO、10%甘油和8%蔗糖的冰冻保护剂,然后以1℃/m in的速度从0℃降温至-80℃,过夜后,投入液氮,最后利用40℃温水浴快速解冻低温保存的样品。低温预处理提高人参花药愈伤组织超低温保存成活率的蛋白质组学分析结果表明:4℃预处理前后的样品中共有43个蛋白点发生了明显的表达变化(Fold change≥1.5),利用MALDI-TOF-TOF串联质谱仪,对其进行质谱分析,其中有36个被成功鉴定;利用生物信息学分析对其进行功能分类,大致可分为八大类,分别是:胁迫响应类蛋白;氨基酸、蛋白质合成分解类蛋白;分子伴侣;电子传递、ATP合成类蛋白;碳水化合物代谢类蛋白;核酸代谢类蛋白;未知功能蛋白。5.人参花药愈伤组织、花药苗及幼胚组培苗中皂苷含量测定的结果表明,不同培养条件、不同部位中的人参皂苷含量有显著差异:继代培养在1号培养基上的大马牙人参花药愈伤组织中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2和Rd的总量(0.258%)显著高于培养在20号培养基上者(0.112%);生长在L3培养基上的人参幼胚苗(叶)中六种皂苷总量最高,为8.355%,显著高于生长在其它培养基上者(2.100%-6.660%);由大马牙人参花药诱导产生的愈伤组织中六种人参皂苷的总量(0.258%)远远小于由其分化产生的苗(叶)中皂苷的总量(5.291%)。本研究通过一系列试验,获得、鉴定、保存并评价了大量人参花药愈伤组织、人参花药苗和杂种幼胚组培苗,丰富了我国人参属植物种质资源库,为加快人参新品种的选育奠定了方法和物质基础,也将为人参基因组学的研究提供材料支撑。
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